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文檔簡介
1、目的:細(xì)菌質(zhì)粒包括F因子、R因子、Col因子、Ti因子、巨大質(zhì)粒和降解性質(zhì)粒等。其中R因子又稱為R質(zhì)粒,R質(zhì)粒上攜帶著耐藥基因,賦予了細(xì)菌對某些抗生素的耐藥性。近30年來,國內(nèi)外的一些研究者積極尋找一種有效的方法去消除耐藥質(zhì)粒,以逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥。淋病是我國目前最常見的性傳播疾病之一,隨著抗生素的廣泛使用,淋病耐瑟氏菌的耐藥性也越來越嚴(yán)重。大量研究發(fā)現(xiàn)淋病奈瑟氏菌的耐藥主要是由質(zhì)粒介導(dǎo)。國內(nèi)有用清熱解毒類中藥對G-桿菌進(jìn)行質(zhì)粒消除的研究,這
2、類中藥正好是中醫(yī)治療淋病的方劑,我們可以推測中醫(yī)治療淋病的基礎(chǔ)與質(zhì)粒消除有一定的聯(lián)系。本實驗擬在研究三黃膠囊是否對淋病奈瑟氏菌R質(zhì)粒有消除作用,以及隨著三黃膠囊作用時間的延長能否增強其消質(zhì)效果。 方法:①淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒提?。哼x用10株2008年在四川省皮膚性病研究所門診病員分離經(jīng)氧化酶試驗及糖發(fā)酵試驗鑒定的淋病奈瑟氏菌,先將其在10個無選擇的T-M培養(yǎng)基上復(fù)蘇,24小時后將其轉(zhuǎn)種于新的10個T-M培養(yǎng)基,待24小時后再用接種環(huán)
3、分別刮取10個培養(yǎng)基上的淋病奈瑟氏菌于10個盛有1ml生理鹽水的Ep管中并標(biāo)明編號,用加樣槍輕輕吹打菌液使其混勻。將Ep管中的菌液按照AxyPrep質(zhì)粒提取盒說明書的步驟提取質(zhì)粒,提取完畢后將10株淋病奈瑟氏菌的質(zhì)粒提取液分別加入溴酚藍(lán)染色,用加樣槍將染色后的質(zhì)粒提取液及DNAmarker(300bp-10000bp)加入已備好的2%瓊脂糖凝膠樣孔中100v電泳40min,而后在紫外透視光下觀察質(zhì)粒條帶并做好記錄。②三黃膠囊亞抑菌濃度的
4、測定:將上述10株淋病奈瑟氏菌株復(fù)蘇轉(zhuǎn)種后用接種環(huán)分別刮取少許菌株于10個盛有1ml生理鹽水的玻璃試管中將其混勻,并將其置于光密度儀中,調(diào)整菌量和生理鹽水量使其光密度為0.3,從而制備好了菌液濃度為105/ml的淋病奈瑟氏菌液。將菌液用接種器接種在含不同量(6.25ul、12.5ul、25ul、50ul、100ul、200ul)三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基上(每個培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基的量為15ml),24h后觀察其生長情況,從而確定其亞抑菌濃
5、度,進(jìn)而制備含亞抑菌濃度三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基。③淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒消除實驗:將上述10株淋病奈瑟氏菌再次按同樣方法復(fù)蘇、轉(zhuǎn)種,于24h后再次轉(zhuǎn)種于含亞抑菌濃度三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基中,分別作用24h、48h、72h后提取其質(zhì)粒電泳觀察質(zhì)粒帶的變化,每24h都轉(zhuǎn)種一次,具體操作如下:將轉(zhuǎn)種24h后的淋病奈瑟氏菌接種于含亞抑菌濃度三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時按照第一次提取質(zhì)粒的方法提取其質(zhì)粒并電泳與消質(zhì)前電泳結(jié)果作
6、對比,此時將淋病奈瑟氏菌再次轉(zhuǎn)種于含三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基中,24小時后按同樣方法提取其質(zhì)粒電泳與消質(zhì)前電泳結(jié)果作對比,此時將淋病奈瑟氏菌再次轉(zhuǎn)種于含三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基中,24小時后提取質(zhì)粒電泳與消質(zhì)前結(jié)果對比。最后將經(jīng)三黃膠囊作用24h、48h、72h的三次電泳結(jié)果作對比。 結(jié)果:所有入選的淋病奈瑟氏菌均生長良好,并且未受到污染。⑴提取質(zhì)粒的概況:10株淋病耐瑟氏菌中9株可見較清晰的質(zhì)粒帶,其分子量均為7.4K
7、b即亞洲型PPNG株。⑵淋病耐瑟氏菌在含不同量(6.25ul、12.5ul、25ul、50ul、100ul、200ul)三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基上(每個培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基的量為15ml)培養(yǎng)24h后觀察到淋病奈瑟氏菌均能生長,因此將三黃膠囊的亞抑菌濃度(即能使淋病奈瑟氏菌生長的最高藥物濃度),確定為200ul/培養(yǎng)皿,此濃度的消質(zhì)液即為實驗所用的消質(zhì)劑。⑶10株淋病奈瑟氏菌在含三黃膠囊成分的T-M培養(yǎng)基上分別生長24h、48h、72h,
8、分別提取三個時間點的淋病奈瑟氏菌的質(zhì)粒電泳后觀察其質(zhì)粒帶的情況(與消質(zhì)前相比較):作用24h后質(zhì)粒條帶減少2條;48h后減少3條;72h后減少8條。經(jīng)卡方檢驗消質(zhì)劑作用24h、48h的淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒陰轉(zhuǎn)率與消質(zhì)前淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒陰轉(zhuǎn)率沒有顯著差異性(P>0.05),消質(zhì)劑作用72h的淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒陰轉(zhuǎn)率與消質(zhì)前淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒陰轉(zhuǎn)率有顯著差異性(P<0.05)。經(jīng)卡方檢驗24h、48h、72h三個時間點消質(zhì)率有顯著差異性(P<0.0
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