參附注射液、松果菊苷和蟲草素等抗腫瘤活性及對(duì)GJIC的影響.pdf

1、研究目的: 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于采用對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或殺傷作用進(jìn)行篩選與GJIC的相關(guān)活性篩選相結(jié)合，初步找出具有直接細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或殺傷作用的中藥活性成分，并探求能提高GJIC的活性成分，從而為中藥的臨床應(yīng)用和作用新靶點(diǎn)的研究提供新的參考資料。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.五種惡性腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)時(shí)間和密度的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)采用活細(xì)胞增殖 Alamar Blue 試劑分別測(cè)定人胃癌細(xì)胞株 SGC-7901、人肝癌細(xì)胞

2、株 Hep-G2、人急性早幼粒白血病細(xì)胞株 HL-60、小鼠肝癌細(xì)胞株H22和小鼠黑素瘤細(xì)胞株B16五種腫瘤細(xì)胞株在不同濃度各個(gè)時(shí)間段的吸光值，根據(jù)其還原率確定最佳的細(xì)胞生長(zhǎng)條件。 2.中藥活性成分抗腫瘤活性研究 2.1 所選藥物 黃芪甲苷、人參皂苷 Rh2、人參皂苷 Rg3、淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷、阿魏酸、松果菊苷、葫蘆巴堿、蟲草素、靈芝多糖、靈芝三萜和參附注射液。 2.2 細(xì)胞增殖抑制或殺傷實(shí)驗(yàn)

3、 分別收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞 SGC-7901、人肝癌細(xì)胞 Hep-G2 和小鼠黑素瘤細(xì)胞B16，按照每孔4000個(gè)細(xì)胞接種入96孔板。過夜培養(yǎng)24h后加藥。收獲人白血病細(xì)胞 HL-60 和小鼠肝癌細(xì)胞 H22，按照每孔4000 個(gè)細(xì)胞接種入96孔板后加藥。黃芪甲苷、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rg3、淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷、阿魏酸、松果菊苷、葫蘆巴堿和蟲草素設(shè)6個(gè)濃度，終濃度分別為0μM、5μM、10μM、201μM、40μM和80μM

4、；靈芝多糖和靈芝三萜設(shè)6個(gè)濃度，終濃度分別為 0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和 80mg/L；參附注射液設(shè)6個(gè)濃度，終濃度分別為 0mL/L、5mL/L、10mL/L、20mL/L、40mL/L 和 80mL/L，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，補(bǔ)足 180μl 培養(yǎng)液于37℃、5％CO<,2>及飽和濕度條件下培養(yǎng)。每孔加入 20μl Alamar Blue，用酶標(biāo)儀分別測(cè)定0h、24h、48h 和 72h，570

5、nm 和 630nm 波長(zhǎng)的吸收值，按照說明書的公式，計(jì)算每個(gè)濃度及時(shí)間段存活率。其中，A<,570>和A<,630>分別是藥物處理組細(xì)胞在570nm和630nm波長(zhǎng)的吸收值，A<'0><,570>和AA<'0><,630>分別是對(duì)照組細(xì)胞在570nm和630nm波長(zhǎng)的吸收值。 以細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)，繪制各組細(xì)胞的生存曲線，并計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的IC<,50>值。 2.3 流式細(xì)胞儀分析 把人白血病

6、細(xì)胞 HL-60 按每孔約 2.5×10<'6>個(gè)細(xì)胞接種到六孔板中，分為對(duì)照組，松果菊苷20μM、松果菊苷40μM、蟲草素20μM、蟲草素40μM、參附注射液 20mL/L 和參附注射液 40mL/L 共7組，每組3復(fù)孔。藥物孵育 48h 后，各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化收集后PBS洗3次，用預(yù)冷的70％乙醇固定后，PI染色，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡率和細(xì)胞周期分析檢測(cè)。 2.4 瓊脂糖凝膠電泳分別收集 經(jīng)過參附注射液不同濃度處理過

7、的H22細(xì)胞，PBS洗滌后采用申能博彩生物科技有限公司試劑盒步驟提取細(xì)胞 DNA，取 7μL DNA 提取液加溴芬蘭 3μL，上樣于1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳 (電壓30V，2h)，UV 下觀察結(jié)果，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。 3 中藥活性成分對(duì)GJIC和Cx43表達(dá)的影響 對(duì)參附注射液和松果菊苷、蟲草素等十一種補(bǔ)益中藥活性成分中，分為正常對(duì)照組、芹黃素陽性對(duì)照組、18-α甘草酸陰性對(duì)照組、黃芪甲苷組、人參皂苷 Rh2 組、人

8、參皂苷Rg3組、淫羊藿苷組、川續(xù)斷皂苷組、阿魏酸組、松果菊苷組、葫蘆巴堿組、蟲草素組、靈芝多糖組、靈芝三萜組和參附注射液組共 15組。藥物孵育 36h 后進(jìn)行熒光染料劃痕實(shí)驗(yàn)，初步篩選出對(duì)GJIC有作用的藥物，并對(duì)比這些中藥活性成分對(duì)Cx43 表達(dá)的影響。觀察LY 自傷沿列細(xì)胞向鄰近細(xì)胞傳遞的距離進(jìn)行半定量檢測(cè)。FITC間接免疫熒光法通過 FITC 標(biāo)記的 Cx43 抗體特異結(jié)合來檢測(cè)中藥活性成分對(duì) Hep-G2細(xì)胞株的 Connexi

9、n 43 表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1 五種惡性腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)時(shí)間和密度的測(cè)定結(jié)果顯示：五種細(xì)胞株在24-72小時(shí)之間，20000個(gè)/ml (即4000個(gè)/孔，每孔總體積200μl)的細(xì)胞密度時(shí)，alamarBlue還原率與時(shí)間有線性關(guān)系。 2 中藥活性成分對(duì)腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或殺傷作用 ①鏡下觀察有明顯細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或殺傷作用的是：松果菊苷處理過的 Hep-G2 細(xì)胞株；蟲草素處理過的HL-60細(xì)胞株

10、；參附注射液處理過的HL-60和H22細(xì)胞株。 ②A1amar Blue法檢測(cè)結(jié)果：松果菊苷在80μM濃度下對(duì)Hep-G2 細(xì)胞株生長(zhǎng)有抑制效應(yīng)，但抑制率不高，80μM 濃度下也只有30.91％。各組存活率為：92.69±3.35％、88.33±2.12％、80.97±2.50％、76.95±1.40％和69.09±1.11％。IC<,50>為467.8μM(368.3μg/mL)。蟲草素在80μM 濃度下對(duì)HL-60細(xì)胞株生長(zhǎng)

11、有較好的抑制效應(yīng)，各組存活率為：100±3.73％、95.31±3.57％、90.66±2.30％、86.07±2.88％、70.64±1.56％、65.72±2.44％。其 IC<,50>為155μM (46.5μg/mL)。參附注射液作用48h，Alamar Blue檢測(cè)H22細(xì)胞株各組存活率分別為：100±4.93％、104.31±3.19％、97.31±4.53％、66.44±2.94％、18.01±3.93％、2.54±1.3

12、5％。IC<,50>為26.51mL/L。用MTT法檢測(cè)HL-60存活率為87.5±8.02％、56.45±5.03％、38.38±7.48％，IC<,50>為68mL/L。其余各藥物顯微鏡下觀察未見明顯殺傷作用。Alemir Blue 法檢測(cè)結(jié)果存活率很高。 ③PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，HL-60 細(xì)胞株分別經(jīng)蟲草素 40μM 處理 48h 凋亡率為 1.36％；參附注射液40mL/L 處理 48h 凋亡率為 4.20％

13、。其余均無明顯誘導(dǎo)凋亡作用。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示蟲草素組 S 期細(xì)胞明顯增多，G2/M 期細(xì)胞比對(duì)照組明顯減少。 ④參附注射液對(duì)H22作用，在20mL/L和40mL/L 的濃度下均能出現(xiàn)典型的凋亡 ladder條帶。說明參附注射液能誘導(dǎo)H22細(xì)胞株產(chǎn)生凋亡。 3 中藥活性成分對(duì) Hep-G2 的 GJIC 和 Cx43 表達(dá)的影響 ①SL/DT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：空白對(duì)照組細(xì)胞的熒光染料主要出現(xiàn)在劃痕旁1-2列細(xì)胞中而

14、且亮度低(±)，細(xì)胞間染料傳輸功能差：Hep-G2細(xì)胞株分別經(jīng)陽性對(duì)照芹黃素、松果菊苷、葫蘆巴堿和參附注射液處理24小時(shí)后，熒光染料不僅出現(xiàn)在劃痕的附近細(xì)胞內(nèi)，而且在劃痕以外的3-4列細(xì)胞內(nèi)也出現(xiàn)了明顯熒光(++++)。說明出現(xiàn)了細(xì)胞間染料傳輸?shù)默F(xiàn)象，說明細(xì)胞的間隙連接通訊功能獲得增強(qiáng)。 ②間接免疫熒光檢測(cè)Cx43，結(jié)果顯示：空白對(duì)照組細(xì)胞得分為1.4±0.55，松果菊苷組得分為1.6±0.55，蟲草素組得分為0.6±0.45，

15、淫羊藿苷組得分為3.4±0.55，葫蘆巴堿組得分為2.0±0.7l，得分為2.2±0.84，參附注射液組得分為3.4±0.89。結(jié)果表明松果菊苷、葫蘆巴堿、人參皂苷Rh2、淫羊藿苷組和參附注射液組的Cx43表達(dá)增強(qiáng)。 結(jié)論: ①參附注射液對(duì) H22和HL-60 細(xì)胞株有較明顯的細(xì)胞毒作用：A.鏡下觀察發(fā)現(xiàn)藥物作用組細(xì)胞有形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞發(fā)泡皺縮，細(xì)胞碎片增多，說明參附注射液對(duì)H22和HL-60有殺傷作用。B.MTT和Al

16、amar Blue實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組細(xì)胞存活率下降，且呈濃度依賴性。C.參附注射液作用 HL-60 細(xì)胞株 48 小時(shí) IC<,50>為26.51mL/L，作用H22細(xì)胞株48小時(shí)IC<,50>為68mL/L。D.流式細(xì)胞術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳說明參附注射液的殺傷作用是通過誘導(dǎo)凋亡。 ②蟲草素對(duì)HL-60細(xì)胞株生長(zhǎng)呈現(xiàn)抑制增殖作用：A．鏡下觀察發(fā)現(xiàn)藥物作用組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組無差別，細(xì)胞碎片少，說明蟲草素主要是抑制HL-60細(xì)胞的增殖，

17、而不是促進(jìn)殺傷。B.Alamar Blue實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組細(xì)胞存活率下降，且呈濃度依賴性。C.蟲草素作用HL-60細(xì)胞株24小時(shí)IC<,50> 為 155μM (46.5μg/mL)。D.流式細(xì)胞術(shù)分析說明蟲草素作用HL-60細(xì)胞后，G2/M 期細(xì)胞比對(duì)照組減少，且將細(xì)胞阻滯在S期。提示蟲草素對(duì)靶腫瘤細(xì)胞的作用有周期特異性，其代謝產(chǎn)物可以摻入DNA，進(jìn)而抑制DNA生成。 ③松果菊苷對(duì) Hep-G2 細(xì)胞也有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或殺傷作用