IL-1β激活p38蛋白激酶增加胃腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、胃癌是世界各地最為常見的惡性腫瘤之一，在我國，其發(fā)生率和死亡率占惡性腫瘤的第二位，侵襲和轉(zhuǎn)移是導致胃癌患者死亡的主要原因。因此，深入探討引起增加胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移的作用及機制,進一步抑制胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移,對于胃癌的臨床治療與預(yù)后具有深遠的意義。白細胞介素-1β（IL-1β）已被證實與胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其分子機制尚不清楚。p38蛋白激酶是絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族的主要成員之一，是調(diào)控IL-1β信號通路的主要激酶。因此，

2、著眼于研究p38蛋白激酶在IL-1β介導的胃腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及其機制。目前尚未見相關(guān)文獻報道。
　　目的：
　　探討IL-1β介導的p38蛋白激酶在胃腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，并從細胞水平、臨床樣本、動物水平三方面初步探討其作用機制，旨在闡明其作用及機制并為胃腺癌患者尋找一種新的治療方法提供良好的實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、應(yīng)用Western blot技術(shù)在胃腺癌細胞株中驗證IL-1β是否能激活p

3、38蛋白激酶；
　　2、應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(siRNA技術(shù))結(jié)合p38信號途徑特異性抑制劑SB202190和Transwell遷移侵襲實驗檢測IL-1β激活p38蛋白激酶對胃腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響；
　　3、應(yīng)用siRNA技術(shù)結(jié)合p38信號途徑特異性抑制劑SB202190和RT-PCR檢測IL-1β激活p38蛋白激酶對胃腺癌細胞中MMP2、MMP9 mRNA表達的影響；
　　4、應(yīng)用siRNA技術(shù)，通過轉(zhuǎn)染MMP

4、2siRNA、MMP9 siRNA以及MMP2/MMP9 siRNA和應(yīng)用MMP2/9抑制劑BiPS進一步檢測IL-1β增加胃腺癌細胞遷移和侵襲的可能機制是否涉及MMP2和MMP9；
　　5、應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測人胃腺癌組織樣本中磷酸化p38（p-p38）的表達及其表達強度與IL-1β、MMP2、MMP9表達強度之間的相關(guān)性；
　　6、應(yīng)用siRNA技術(shù)結(jié)合動物實驗、RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測敲減p38再接受 IL-1β

5、刺激前后裸鼠胃癌肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)及裸鼠胃癌肺轉(zhuǎn)移組織中p38/p-p38、MMP2、MMP9 mRNA和蛋白質(zhì)的表達。
　　結(jié)果：
　　1、IL-1β的刺激，可激活胃腺癌細胞AGS和MKN-45的p38蛋白激酶Western blot結(jié)果顯示：在IL-1β刺激后30min，兩株胃腺癌細胞AGS和MKN-45中的p38蛋白激酶均可被IL-1β激活，發(fā)生磷酸化；p38抑制劑SB202190預(yù)作用于細胞3h后再用I L-1β刺激，p3

6、8蛋白激酶磷酸化則被抑制，表明IL-1β激活p38蛋白激酶具有較強的特異性。
　　2、IL-1β激活p38蛋白激酶可增加胃腺癌細胞AGS和MKN-45遷移和侵襲能力Transwell測定結(jié)果表明：接受IL-1β刺激后，胃腺癌細胞AGS和MKN-45遷移和侵襲作用增強，與未接受刺激的細胞相比，差異具有統(tǒng)計學意義(p﹤0.05)；轉(zhuǎn)染p38siRNA或用p38抑制劑SB202190預(yù)處理細胞，則胃腺癌細胞上述作用明顯減弱，表明IL-1

7、β增加胃腺癌細胞遷移和侵襲的作用是通過激活p38蛋白激酶。
　　3、IL-1β激活p38蛋白激酶通過上調(diào)MMP2和MMP9的表達增加胃腺癌細胞遷移和侵襲RT-PCR測定結(jié)果表明，IL-1β刺激后，胃腺癌AGS和MKN-45細胞中的MMP2和MMP9的mRNA表達增加，與未接受刺激的細胞相比，差異具有統(tǒng)計學意義(p﹤0.05)；轉(zhuǎn)染p38siRNA和用p38抑制劑SB202190預(yù)處理的胃腺癌細胞接受IL-1β刺激后，MMP2和MM

8、P9的mRNA表達降低。上述結(jié)果初步表明IL-1β激活p38蛋白激酶增加胃腺癌細胞遷移和侵襲的機制涉及上調(diào)MMP2和MMP9。
　　4、Transwell測定結(jié)果表明：與siRNA陰性對照轉(zhuǎn)染組比較，MMP2 siRNA轉(zhuǎn)染組和MMP9 siRNA轉(zhuǎn)染組以及MMP2/MMP9抑制劑BiPS預(yù)處理組的胃腺癌細胞接受IL-1β刺激后遷移和侵襲能力明顯減弱，結(jié)果進一步表明：IL-1β增加胃腺癌細胞遷移和侵襲的機制涉及上調(diào)MMP2和MMP

9、9。
　　5、免疫組化結(jié)果表明：在105例測定的胃腺癌樣本中，與配對非癌組織樣本比較，53例胃腺癌組織(50.48％)過表達磷酸化的 p38(p-p38)。p-p38的過表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織學類型和腫瘤分化程度無關(guān)(p﹥0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤侵襲程度（至漿膜外）密切相關(guān)(p﹤0.05)。同時，p38的過表達與IL-1β, MMP2, MMP9的高表達具有顯著的相關(guān)性(r=0.72, p﹤0.01;r=0

10、.63, p﹤0.01;r=0.58, p﹤0.05）。
　　6、在裸鼠胃癌肺轉(zhuǎn)移形成實驗中，與注射IL-1β+轉(zhuǎn)染 scrambled siRNA的MKN-45細胞組比較，注射PBS+轉(zhuǎn)染scrambled siRNA的MKN-45細胞組和注射IL-1β+轉(zhuǎn)染p38siRNA的MKN-45細胞組的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯少，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；注射IL-1β+轉(zhuǎn)染scrambled siRNA組的p38（p-p38）、MMP