TAK1通過(guò)激活p38 MAPK負(fù)性調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞中IL-1α誘導(dǎo)的SDF-1表達(dá).pdf

1、目的：明確IL-1α對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中SDF-1表達(dá)的影響，探討蛋白激酶TAK1對(duì)SDF-1表達(dá)的調(diào)控作用及其相關(guān)機(jī)制，研究血管平滑肌細(xì)胞中TAK1信號(hào)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的影響。
　　方法：體外分離培養(yǎng)原代大鼠血管平滑肌細(xì)胞，并予以重組大鼠IL-1α處理，采用qRT-PCR及ELISA檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞SDF-1的表達(dá)。構(gòu)建RNA干擾慢病毒載體用于細(xì)胞感染，獲得C/EBPβ或TAK1表達(dá)被敲低的血管平滑肌細(xì)胞并用于實(shí)驗(yàn)。以We

2、stern blotting檢測(cè)C/EBPβ和TAK1的表達(dá)和磷酸化水平，結(jié)合對(duì)SDF-1表達(dá)的檢測(cè)，明確TAK1對(duì)SDF-1表達(dá)的影響及C/EBPβ在其中的作用。Western blotting檢測(cè)TAK1敲低對(duì)TAK1及其下游激酶（IKKβ，ERK，JNK和p38 MAPK）磷酸化的影響。然后，觀察不同的抑制劑預(yù)處理對(duì)C/EBPβ和SDF-1表達(dá)的調(diào)控作用，并進(jìn)而比對(duì)同一種抑制劑在不同細(xì)胞（TAK1或 C/EBPβ被敲低的細(xì)胞及相應(yīng)

3、的對(duì)照細(xì)胞）中的調(diào)控效應(yīng)的差異，識(shí)別在 TAK1下游介導(dǎo)其對(duì)SDF-1表達(dá)的影響的信號(hào)通路。觀察TAK1敲低和相關(guān)的下游信號(hào)抑制劑對(duì)經(jīng)活性氧清除劑預(yù)處理的血管平滑肌細(xì)胞中NRF2、C/EBPβ和SDF-1表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討TAK1調(diào)控SDF-1表達(dá)的分子機(jī)制。最后，以 Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn)檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞條件培養(yǎng)上清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移活性的誘導(dǎo)作用，結(jié)合SDF-1的中和抗體和CXCR4拮抗劑的使用，探討血管平滑肌細(xì)胞

4、中TAK1信號(hào)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移活性的影響及機(jī)制。
　　結(jié)果：IL-1α可以通過(guò)誘導(dǎo)C/EBPβ的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)SDF-1的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，該誘導(dǎo)作用可被IKKβ抑制劑阻斷。TAK1敲低可減弱IL-1α誘導(dǎo)的IKKβ、ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化，但在TAK1表達(dá)被敲低的血管平滑肌細(xì)胞中，IL-1α誘導(dǎo)的C/EBPβ和SDF-1表達(dá)卻顯著增強(qiáng)。另一方面，在ERK、JNK和p38 MAPK的抑制劑中，只有p38

5、 MAPK抑制劑可明顯增強(qiáng)IL-1α誘導(dǎo)的C/EBPβ和SDF-1表達(dá)。在IL-1α處理的細(xì)胞中，TAK1敲低和p38 MAPK抑制劑都能引起程度相當(dāng)?shù)腃/EBPβ和SDF-1表達(dá)增強(qiáng)，但p38 MAPK抑制劑并不能進(jìn)一步升高TAK1表達(dá)被敲低的細(xì)胞中 IL-1α誘導(dǎo)的 SDF-1表達(dá)；且 TAK1敲低和p38 MAPK抑制劑對(duì)IL-1α誘導(dǎo)的SDF-1表達(dá)的增強(qiáng)作用也都可被C/EBP?敲低明顯減弱。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，TAK1敲低和p38

6、 MAPK抑制劑均可增強(qiáng)IL-1α處理的血管平滑肌中ROS依賴性的NRF2上調(diào)，且TAK1敲低和p38 MAPK抑制劑對(duì)IL-1α誘導(dǎo)的C/EBPβ和SDF-1表達(dá)的增強(qiáng)作用均可被ROS清除劑和NRF2抑制劑所消除。Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn)的結(jié)果也顯示，與PBS處理的血管平滑肌細(xì)胞條件培養(yǎng)上清相比，IL-1α處理的血管平滑肌細(xì)胞條件培養(yǎng)上清能明顯誘導(dǎo)SDF-1/CXCR4信號(hào)依賴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移，且血管平滑肌細(xì)胞TAK1基因

7、敲低能進(jìn)一步增強(qiáng)該誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　結(jié)論：在血管平滑肌細(xì)胞中，IL-1α可通過(guò)誘導(dǎo) IKKβ信號(hào)依賴的 C/EBPβ的上調(diào)促進(jìn)SDF-1的表達(dá)，而位于IKKβ上游的TAK1也可通過(guò)激活p38 MAPK對(duì)IL-1α誘導(dǎo)的C/EBPβ和SDF-1的表達(dá)發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。另一方面，在IL-1α處理的血管平滑肌細(xì)胞中，TAK1的敲低可促進(jìn)SDF-1/CXCR4信號(hào)依賴的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移。因此，這些結(jié)果表明TAK1是血管平滑肌SDF-1表