血管平滑肌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)產(chǎn)生SDF-1α促進(jìn)移植物動(dòng)脈硬化.pdf

1、目的:移植物動(dòng)脈硬化是以彌漫性內(nèi)膜增生為特征的慢性血管增殖性疾病,也是導(dǎo)致遠(yuǎn)期移植器官功能喪失、限制其遠(yuǎn)期療效的主要原因。移植物動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡是器官移植后的早期事件,有研究提示移植物動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡可能通過募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與移植物動(dòng)脈硬化。本研究擬探討移植物動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡對移植物動(dòng)脈硬化的促進(jìn)作用及其分子機(jī)制。方法:原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞,構(gòu)建并轉(zhuǎn)染攜帶 SM-22α啟動(dòng)子的野生型 p53基因慢病毒載體,

2、采用DAPI細(xì)胞核染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá) p53對血管平滑肌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用,采用Western blot和ELISA分析檢測觀察血管平滑肌細(xì)胞凋亡對細(xì)胞因子 SDF-1α,TGF-β和PDGF-BB表達(dá)的影響。體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,制備 p53過表達(dá)血管平滑肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液,采用Transwell細(xì)胞遷移分析和BrdU標(biāo)記法檢測血管平滑肌細(xì)胞凋亡對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖的影響;并應(yīng)用選擇性細(xì)胞信號(hào)阻斷劑對骨髓間充質(zhì)干

3、細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,以探討血管平滑肌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖的分子機(jī)制。建立大鼠主動(dòng)脈移植模型,構(gòu)建并轉(zhuǎn)染攜帶 SM-22α啟動(dòng)子的BclxL基因慢病毒載體,采用TUNEL分析檢測移植動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡情況;采用免疫組化染色檢測移植動(dòng)脈壁中SDF-1α的蛋白水平;采用HE和Masson染色進(jìn)行組織病理學(xué)分析,探討 BclxL基因轉(zhuǎn)染對移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成的影響;并應(yīng)用免疫雙熒光染色探討 BclxL基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

4、參與內(nèi)膜增生的影響。同時(shí),建立異系大鼠主動(dòng)脈移植模型,對受體大鼠分別給予 mTOR抑制劑 rapamycin和MAPK/ERK抑制劑 PD98059治療,檢測其對移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成的影響,以探討PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路在移植物動(dòng)脈硬化中的作用。結(jié)果:慢病毒介導(dǎo) p53過表達(dá)有效誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡,凋亡血管平滑肌細(xì)胞釋放趨化因子SDF-1α,并誘導(dǎo)周圍血管平滑肌細(xì)胞表達(dá) SDF-1α,引起 p53過表達(dá)血

5、管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液中SDF-1α水平明顯升高。血管平滑肌細(xì)胞凋亡可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和增殖,以 SDF-1α中和抗體可阻斷該作用。Western blot分析顯示血管平滑肌細(xì)胞凋亡活化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路,且該作用是由 SDF-1α介導(dǎo)。用PI3K/Akt/mTOR抑制劑 Ly294002和rapamycin或 MAPK/ERK抑制劑 PD98059對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,

6、可有效阻斷血管平滑肌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖。與同系移植相比,異系移植動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞大量凋亡,SDF-1α蛋白水平明顯升高,8周后異系移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成并伴有新生內(nèi)膜細(xì)胞 PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路的活化。慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 BclxL基因,在 SM-22α啟動(dòng)子調(diào)控下目的基因選擇性在移植動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞高表達(dá),使中膜平滑肌細(xì)胞凋亡明顯減少,移植動(dòng)脈中膜 SDF-1α的表達(dá)下調(diào)及其在血清中的

7、含量下降;并且,伴隨早期移植動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡抑制,8周后異系移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜中CD90和CD105雙陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,且血管新生內(nèi)膜面積和管腔狹窄程度均顯著減少。同樣,rapamycin和PD98059均能有效減少骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞募集至新生內(nèi)膜以及移植動(dòng)脈硬化。結(jié)論:移植動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡通過產(chǎn)生SDF-1α募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,從而在移植物動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信

8、號(hào)傳導(dǎo)通路活化是血管平滑肌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖的分子機(jī)制。以血管平滑肌細(xì)胞凋亡為干預(yù)靶點(diǎn)將是防治移植物動(dòng)脈硬化的一個(gè)有效策略。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分血管平滑肌細(xì)胞凋亡通過誘導(dǎo)產(chǎn)生 SDF-1α促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖
　　目的:移植物動(dòng)脈硬化是以彌漫性內(nèi)膜增生為特征的慢性血管增殖性疾病。研究提示移植物動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡可能通過募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與移植物動(dòng)脈硬

9、化。本研究擬探討血管平滑肌細(xì)胞凋亡對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植物動(dòng)脈體外遷移和增殖的影響及其分子機(jī)制。方法:原代培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞,構(gòu)建并轉(zhuǎn)染攜帶 SM-22α啟動(dòng)子的野生型 p53基因慢病毒載體,采用DAPI細(xì)胞核染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá) p53對血管平滑肌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用,采用Western blot和ELISA分析檢測觀察血管平滑肌細(xì)胞凋亡對細(xì)胞因子 SDF-1α,TGF-β和PDGF-BB表達(dá)的影響。體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)

10、胞,制備 p53過表達(dá)血管平滑肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液,采用Transwell細(xì)胞遷移分析和BrdU標(biāo)記法檢測血管平滑肌細(xì)胞凋亡對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖的影響;并應(yīng)用選擇性細(xì)胞信號(hào)阻斷劑對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,以探討血管平滑肌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖的分子機(jī)制。結(jié)果:慢病毒介導(dǎo) p53過表達(dá)有效誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡,凋亡血管平滑肌細(xì)胞釋放趨化因子 SDF-1α,并誘導(dǎo)周圍血管平滑肌細(xì)胞表達(dá) SDF-1α,引起 p53過

11、表達(dá)血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液中SDF-1α水平明顯升高。血管平滑肌細(xì)胞凋亡可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和增殖,以 SDF-1α中和抗體可阻斷該作用。Western blot分析顯示血管平滑肌細(xì)胞凋亡活化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路,且該作用是由 SDF-1α介導(dǎo)。用PI3K/Akt/mTOR抑制劑 Ly294002和rapamycin或 MAPK/ERK抑制劑 PD98059對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)

12、處理,可有效阻斷血管平滑肌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖。結(jié)論:血管平滑肌細(xì)胞凋亡通過產(chǎn)生 SDF-1α誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和增殖,而PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路活化是血管平滑肌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖的分子機(jī)制。
　　第二部分 移植物動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)移植物動(dòng)脈硬化
　　目的:移植物動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡是器官移植后的早期事件,但在移植物

13、動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制均不清楚。本研究擬探討移植物動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡對移植物動(dòng)脈硬化的促進(jìn)作用及其分子機(jī)制。方法:建立大鼠主動(dòng)脈移植模型,構(gòu)建并轉(zhuǎn)染攜帶 SM-22α啟動(dòng)子的BclxL基因慢病毒載體,采用TUNEL分析檢測移植動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡情況;采用免疫組化染色檢測移植動(dòng)脈壁中SDF-1α的蛋白水平;采用HE和Masson染色進(jìn)行組織病理學(xué)分析,探討 BclxL基因轉(zhuǎn)染對移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成的影響;并應(yīng)用免疫雙熒光

14、染色探討 BclxL基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與內(nèi)膜增生的影響。同時(shí),建立異系大鼠主動(dòng)脈移植模型,對受體大鼠分別給予 mTOR抑制劑 rapamycin和MAPK/ERK抑制劑 PD98059治療,檢測其對移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成的影響,以探討 PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路在移植物動(dòng)脈硬化中的作用。結(jié)果:與同系移植相比,異系移植動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞大量凋亡,SDF-1α蛋白水平明顯升高,8周后異系移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成

15、并伴有新生內(nèi)膜細(xì)胞 PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路的活化。慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 BclxL基因,在 SM-22α啟動(dòng)子調(diào)控下目的基因選擇性在移植動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞高表達(dá),使中膜平滑肌細(xì)胞凋亡明顯減少,移植動(dòng)脈中膜 SDF-1α的表達(dá)下調(diào)及其在血清中的含量下降;并且,伴隨早期移植動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞凋亡抑制,8周后異系移植動(dòng)脈新生內(nèi)膜中CD90和CD105雙陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,且血管新生內(nèi)膜面積和管腔狹窄程度均顯著減少。