IgA腎病患者尿miRNAs表達(dá)譜檢測及差異miRNAs分析.pdf

1、背景與目的:IgA腎病(IgANephropathy，IgAN)是終末期腎病的主要威因之一，早期的診斷和治療對(duì)防止或延緩IgAN病情進(jìn)展至關(guān)重要。已有研究表明，微小RNA(microRNAs，miRNAs)在IgAN的發(fā)病和進(jìn)展中扮演重要角色，IgAN患者尿沉渣中miR-146a、miR-155、miR-93等miRNAs的表達(dá)水平較健康對(duì)照組變化非常顯著，很有可能成為檢測IgAN的一類新型無創(chuàng)標(biāo)志物。然而目前國內(nèi)外尚無對(duì)IgAN患者尿

2、沉渣中完整miRNAs表達(dá)譜的報(bào)道。因此，本研究旨在通過檢測尿沉渣miRNAs表達(dá)譜，尋找在IgAN中差異表達(dá)的miRNAs，評(píng)估其診斷性能及與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，并通過生物信息學(xué)分析初步探討其在IgAN中可能的作用。
　　方法:本研究設(shè)計(jì)了篩選隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列，納入解放軍總醫(yī)院腎臟病科2013年12月至2015年1月首次經(jīng)腎活檢證實(shí)的IgAN患者、膜性腎病(membranousnephropathy，MN)患者和微小病變腎病(min

3、imal changes disease，MCD)患者，其中MN和MCD患者作為疾病對(duì)照組，同時(shí)設(shè)立健康對(duì)照組。采集晨尿標(biāo)本，通過離心法提取尿沉渣。(1)采用Affymetrix miRNA4.0芯片檢測篩選隊(duì)列尿沉渣miRNAs的表達(dá)譜，通過芯片顯著性分析比較各組miRNAs的表達(dá)差異。采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法重新檢測篩選隊(duì)

4、列樣本。(2)采用RT-qPCR法檢測驗(yàn)證隊(duì)列尿沉渣差異miRNAs的表達(dá)，繪制受試者作業(yè)特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)評(píng)估差異miRNAs診斷IgAN的特異度和敏感度。(3)采用生物信息學(xué)軟件miRWalk對(duì)差異miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測，并應(yīng)用DAVID在線分析軟件對(duì)預(yù)測的靶基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。
　　結(jié)果:篩選隊(duì)列納入了18例IgAN患者（

5、其中Lee氏分級(jí)Ⅰ-Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ-Ⅴ級(jí)患者各6例）、4例MN患者、4例MCD患者和6例健康受試者;驗(yàn)證隊(duì)列納入了102例IgAN患者、41例MN患者、27例MCD患者和34例健康受試者。
　　(1)在篩選隊(duì)列中，miRNA芯片結(jié)果顯示:IgAN組與健康對(duì)照(healthy control，HC)組、MN組和MCD組相比，分別有117種、78種和11種miRNAs的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05且差異倍數(shù)＞2或＜0.5)，但差異m

6、iRNAs之間無交集。在IgANⅠ-Ⅱ級(jí)組和IgANⅢ級(jí)組，分別有4種miRNAs(miR-223-3p、miR-629-5p、miR-3613-3p和miR-4668-5p)和6種miRNAs(miR-150-5p、miR-371b-5p、miR-572、miR-3613-3p、miR-4668-5p和miR-6750-5p)與各對(duì)照組相比的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05且差異倍數(shù)＞2或＜0.5)。RT-qPCR結(jié)果初步驗(yàn)證了其

7、中7種miRNAs的表達(dá)(miR-150-5p、miR-223-3p、miR-3613-3p、miR-371b-5p、miR-4668-5p、miR-572和miR-629-5p)。
　　(2)在驗(yàn)證隊(duì)列中，RT-qPCR結(jié)果顯示:與HC組、MN組、MCD組相比，IgAN組miR-150-5p的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，ROC曲線下面積可達(dá)0.817，敏感度和特異度分別為64.2％和84.8％;miR-3613-3p的表達(dá)

8、水平則顯著降低(P＜0.01)，ROC曲線下面積為0.8，敏感度和特異度分別為67.4％和92.8％。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示miR-3613-3p的表達(dá)水平與24h尿蛋白定量和Lee氏分級(jí)呈正相關(guān)，與腎小球?yàn)V過率呈負(fù)相關(guān)，并且在牛津分型為S0的亞組中表達(dá)水平顯著低于S1亞組。
　　(3)生物信息學(xué)分析的結(jié)果顯示:miR-150-5p預(yù)測的靶基因功能在細(xì)胞增殖、淋巴細(xì)胞的分化、活化和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)等方面有顯著富集，KEGG

9、信號(hào)通路主要富集在Wnt和MAPK通路。miR-3613-3p預(yù)測的靶基因主要參與調(diào)控糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、B細(xì)胞的活化等方面，并且在Wnt通路也具有顯著富集。
　　結(jié)論:IgAN患者尿沉渣miRNAs表達(dá)譜出現(xiàn)了顯著變化，其中miR-150-5p和miR-3613-3p的表達(dá)水平具有一定特異性，對(duì)IgAN的診斷具有一定提示作用，并且miR-3613-3p的表達(dá)水平有助于評(píng)估患者的病情嚴(yán)重程度，有望成為監(jiān)測IgAN的無創(chuàng)指標(biāo)。生物信息學(xué)分