IgA腎病尿沉渣特異性miRNAs篩選與驗(yàn)證及其細(xì)胞來源分析.pdf

1、背景和目的:IgA腎病(IgA nephrophathy, IgAN)是我國最常見的慢性腎臟病,也是導(dǎo)致我國終末期腎臟疾病(尿毒癥)的最主要病因。多數(shù)IgAN是進(jìn)展性疾病,因此,臨床上需要能及時反映IgAN病情變化的生物標(biāo)志物用以診斷、評估病情、指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后。尿沉渣miRNA是2010年以來尋找IgAN標(biāo)志物新的方向,國內(nèi)外也有學(xué)者開展了有益的嘗試,發(fā)現(xiàn)某些miRNAs與IgAN的臨床病理和預(yù)后有一定相關(guān)。但由于是單中心、小樣本研

2、究,對IgAN疾病特征反映并不全面。本課題第一次利用miRNA芯片結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù),高通量篩選IgAN新的miRNA分子標(biāo)志物,進(jìn)而通過熒光定量PCR驗(yàn)證,篩選出幾種IgAN特異性的miRNA標(biāo)志物,評估其對IgAN診斷及病情判斷中的作用。進(jìn)一步明確上述miRNAs標(biāo)志物在尿沉渣中的具體細(xì)胞來源及其可能的作用,為IgAN無創(chuàng)診斷研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:收集中國人民解放軍總醫(yī)院腎臟病科2012年11月至2014年1月首次經(jīng)腎活檢

3、證實(shí)的IgAN患者。正常對照組為年齡性別匹配的健康人。疾病對照組為首次經(jīng)腎活檢證實(shí)的非IgAN原發(fā)性腎小球疾病患者。在腎活檢前留取尿液標(biāo)本,通過離心分離尿沉渣和尿液上清。腎臟病理采用Lee氏分級和半定量評分。1、尿沉渣miRNA芯片檢測:提取尿沉渣總RNA,利用安捷倫公司miRNA芯片V19.0對9個IgAN患者(3個LEE氏II級,3個III級和3個IV-V級)和3個正常人進(jìn)行差異 miRNAs篩選。并與文獻(xiàn)報道的 IgAN腎組織和外

4、周血白細(xì)胞的 miRNAs芯片結(jié)果進(jìn)行對比分析,明確三組不同樣本來源miRNAs表達(dá)趨勢的異同。2、尿沉渣miRNA標(biāo)志物的驗(yàn)證與臨床病理相關(guān)分析:利用SYBR Green熒光定量PCR,擴(kuò)大樣本人群,檢測尿沉渣miRNAs在84個IgAN患者、29個正常人和21個疾病對照組患者中的表達(dá)差異。繪制ROC曲線(receiver operating characteristic curve,受試者作業(yè)特征曲線)評估幾種標(biāo)志物診斷IgAN的敏

5、感度和特異度。并分析其與IgAN臨床、病理指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系。3、利用磁珠分離尿紅細(xì)胞和尿上清液微泡提取等技術(shù),確定miRNAs標(biāo)志物的具體細(xì)胞來源,并分析其可能的生物學(xué)作用。
　　結(jié)果:1.利用高通量miRNAs芯片結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù),篩選出IgAN組和正常對照組尿沉渣差異表達(dá)的miRNAs共214個。此外還發(fā)現(xiàn)有92個miRNAs在IgAN不同病理分級間(LEE氏II級,III級和IV-V級)有表達(dá)差異。通過與文獻(xiàn)報道的IgAN腎

6、組織和外周血白細(xì)胞的miRNAs芯片結(jié)果進(jìn)行對比分析,發(fā)現(xiàn)三種樣本來源miRNAs的表達(dá)趨勢異同。尿沉渣與腎組織miRNAs芯片結(jié)果相比,有54.55％的miRNAs趨勢一致,33.78%趨勢相反。與外周血白細(xì)胞芯片結(jié)果對比,有48.65%的miRNAs趨勢相同,2個miRNAs趨勢相反。匯總?cè)齻€芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn), miR-98,miR-148b,let-7d,miR-374b,miR-17和miR-502-3p在三個miRNA芯片結(jié)果中都

7、有顯著差異。
　　2. IgAN組的尿沉渣miR-25、miR-144、miR-486表達(dá)量顯著高于正常對照組和疾病對照組,而IgAN組miR-135a和miR-150表達(dá)水平則顯著低于正常對照組。尿沉渣miR-25、miR-144和miR-486是IgAN的特異性生物標(biāo)志物,其聯(lián)合診斷IgAN的特異性達(dá)100%,敏感性為89.9%。此外,IgAN組miR-144、miR-486和miR-150在不同Lee氏分級的亞組中,表達(dá)量有

8、顯著差異,miR-144和miR-486在Lee氏III級中表達(dá)量最高,而miR-150則在Lee氏IV-V級中表達(dá)水平最高。miR-150與全球硬化呈正相關(guān)。而miR-144、miR-135a、miR-150與節(jié)段硬化呈正相關(guān)。MiR-486與新月體呈負(fù)相關(guān),而miR-135a則與新月體呈正相關(guān)。有腎血管病變組miR-486的表達(dá)量顯著高于無血管病變組。間質(zhì)纖維化輕度、中度、重度的3組間miR-150的表達(dá)量有顯著差異,重度纖維化組表

9、達(dá)量顯著高于輕度組和中度組。此外,還發(fā)現(xiàn)miR-135a、miR-25和miR-486與包曼囊壁節(jié)段增厚和分層有密切關(guān)系。在臨床指標(biāo)中,miR-25、miR-144、miR-486、miR-150與Cys呈正相關(guān)。MiR-486、miR-150與Scr呈正相關(guān),且miR-486與eGFR呈負(fù)相關(guān)。
　　3.本研究首先發(fā)現(xiàn)miR-25、miR-144和miR-486在尿紅細(xì)胞滿視野組的表達(dá)量顯著高于非滿視野組。利用磁珠分離尿紅細(xì)胞技

10、術(shù)將紅細(xì)胞分離提純(紅細(xì)胞組)發(fā)現(xiàn)上述miRNAs表達(dá)量大大升高,而不含紅細(xì)胞組上述miRNAs表達(dá)量則顯著降低。正常人中上述miRNAs表達(dá)水平很低,在加入自身血紅細(xì)胞后尿沉渣上述miRNAs表達(dá)顯著增加。體外分離尿沉渣中含有的主要細(xì)胞成分,白細(xì)胞、紅細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞,檢測miR-25、miR-144和miR-486的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞中miRNAs的基線水平也顯著高于其他細(xì)胞。
　　4、IgAN組和正常對照組的血紅細(xì)胞mi

11、R-144和miR-486的表達(dá)量無顯著差異,而IgAN組miR-25的表達(dá)顯著低于正常對照組。向IgAN患者尿上清液中加入患者自身血紅細(xì)胞,制造外科性血尿模型,發(fā)現(xiàn)IgAN尿紅細(xì)胞miR-25、miR-144和miR-486的表達(dá)量顯著高于外科性血尿模型組。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),IgAN組尿上清液微泡中miR-144和miR-486表達(dá)量顯著高于正常對照組,且微泡中miR-486相對表達(dá)量很高。
　　5、本研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),miR-25

12、和miR-486這兩個紅細(xì)胞來源的miRNAs與包曼囊壁節(jié)段增厚和分層密切相關(guān),有節(jié)段增厚和分層組miR-25和miR-486的表達(dá)量顯著升高。本研究納入的IgAN患者中,有71.43%存在包曼囊壁節(jié)段增厚和分層,顯著高于疾病對照組的9.52%。這與尿沉渣中IgAN組miR-25和miR-486表達(dá)量顯著高于疾病對照組一致。IgAN尿紅細(xì)胞滿視野伴尿蛋白陽性者包曼囊彌漫性增厚組的腎小球比例為72.34%,高于尿紅細(xì)胞非滿視野伴尿蛋白陽性

13、組的54.5%。
　　結(jié)論:本研究采用miRNA芯片結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析了IgAN尿沉渣miRNAs表達(dá)譜,并發(fā)現(xiàn)與來源于腎組織及外周血白細(xì)胞表達(dá)譜的異同。進(jìn)而篩選出可用于無創(chuàng)診斷IgAN的miRNAs,不僅具有病疾病診斷特異性,而且與臨床、病理指標(biāo)有良好相關(guān)性。尿沉渣miR-25、miR-144和miR-486主要來源于尿中紅細(xì)胞,與包曼囊壁增厚和分層密切相關(guān)。尿紅細(xì)胞miRNA可能通過微泡釋放,發(fā)揮生物學(xué)作用,參與IgAN的