高酮飲食及D-β-羥基丁酸對(duì)帕金森病模型的作用及其機(jī)制.pdf

1、本課題用6-OHDA損傷制作PD體內(nèi)和體外模型。在體內(nèi)模型中，利用Wistar大鼠給予KD預(yù)處理；在體外模型中，利用PC12給予KB的主要成分DβHB預(yù)處理。應(yīng)用Nissl染色、免疫組織化學(xué)、高效液相色譜、細(xì)胞活力測(cè)定、倒置顯微鏡觀察、丫啶橙染色、流式細(xì)胞計(jì)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和多功能酶標(biāo)儀等技術(shù)，從多巴胺神經(jīng)元保護(hù)、抗凋亡、抗氧化和維持線粒體功能等方面對(duì)KD及其主要成分DβHB治療PD的機(jī)制進(jìn)行研究，為KD治療PD的方法探索實(shí)驗(yàn)依據(jù)

2、，為PD的神經(jīng)保護(hù)治療提供可靠的理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)分為5部分，第一部分 KID對(duì)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用 目的：研究KD對(duì)大鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用。 方法：首先給予Wistar大鼠正常飲食和KD預(yù)處理2周后，用6-OHDA兩點(diǎn)注射右側(cè)紋狀體。實(shí)驗(yàn)共分4組，每組5只：ND組、KD組、6-OHDA+ND組和6-OHDA+KD組。注射6-OHDA后繼續(xù)維持ND或KD處理兩周，用Nissl染色及酪氨酸羥化酶免疫組化染色檢測(cè)

3、各組大鼠黑質(zhì)部位TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的變化，TH免疫組化染色檢測(cè)紋狀體TH陽(yáng)性纖維密度的改變，HPLC檢測(cè)紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物3，4-二羥基苯乙酸(dihydroxy-phenylaceticacid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量的變化，分析KD對(duì)大鼠黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用。 結(jié)果： 1.Nissl染色及TH免疫組化表明：ND大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA兩周后，引起

4、右側(cè)黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元退變，與未注射6-OHDA的ND大鼠相比較，多巴胺神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，P＜0.01；而給予KD預(yù)處理的大鼠，右側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA兩周后，黑質(zhì)部位多巴胺神經(jīng)元與6-OHDA+ND組大鼠相比較，數(shù)目明顯增多，P＜0.05；不經(jīng)6-OHDA處理的ND組和KD組大鼠相比較，黑質(zhì)部位多巴胺神經(jīng)元數(shù)目無(wú)明顯差別，P＞0.05。TH免疫組化染色表明：ND大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA兩周后，引起右側(cè)紋狀體部位多巴胺

5、神經(jīng)元纖維末梢光密度值降低，與未注射6-OHDA的ND組大鼠相比較明顯降低，P＜0.01；而給予KD預(yù)處理的大鼠，右側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA兩周后，多巴胺神經(jīng)元纖維末梢光密度值與6-OHDA+ND組大鼠相比較明顯升高，P＜0.05：不經(jīng)6-OHDA處理的ND組和KD組大鼠相比較，多巴胺神經(jīng)元纖維末梢光密度無(wú)明顯差別，P＞0.05。 2.HPLC結(jié)果表明：ND大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA兩周后，引起右側(cè)紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOP

6、AC和HVA明顯降低，與未注射6-OHDA的ND組大鼠相比較，P＜0.01；而給予KD預(yù)處理的大鼠，右側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA兩周后，右側(cè)紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC與6-OHDA+ND組大鼠相比較明顯升高，P＜0.05，HVA升高，但無(wú)明顯差別,P＞0.05；不經(jīng)6-OHDA處理的ND組和KD組大鼠相比較，右側(cè)紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA無(wú)明顯差別，P＞0.05。 結(jié)論：KD對(duì)大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)

7、作用. 第二部分DβHB對(duì)6-OHDA引起的PC12細(xì)胞凋亡的影響 目的：研究DβHB對(duì)6-OHDA引起的PC12細(xì)胞凋亡的影響。 方法：首先給予PCI2細(xì)胞D13HB(終濃度為4 mM)預(yù)處理10 min，然后將6-OHDA(終濃度為50和100μM)加入到體外培養(yǎng)的PC12培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)分為5組：對(duì)照組、50μM6-OHDA組、100μM6-OHDA組、4mM DβHB+50μM 6-OHDA

8、組和4mMDβHB+100μM6-OHDA組。用四唑鹽(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)比色法測(cè)定各組細(xì)胞活力，倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，AO染色觀察各組細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：經(jīng)6-OHDA(終濃度為50和100μM)處理的PC12細(xì)胞，細(xì)胞活力明顯下降，分別為對(duì)照組的75.77±0.

9、84％和47.16±2.37％，與對(duì)照組相比較，P＜0.01。倒置顯微鏡及AO染色顯示，細(xì)胞死亡增加，細(xì)胞皺縮，突起變短，呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化，上述變化依據(jù)6-OHDA濃度變化而變化，具有濃度依賴性的特點(diǎn)。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡率升高，分別為27.17±2.64％和37.89±2.39％(對(duì)照組為1.94±0.52％)，與對(duì)照組相比較，P＜0.05。給予DβHB(終濃度為4mM)預(yù)處理的PC12細(xì)胞經(jīng)6-OHDA處理24h后，細(xì)胞

10、活力升高，分別為對(duì)照組的86.62±1.66％和65.74±1.49％，與相對(duì)應(yīng)的6-OHDA組相比較，P＜0.01。倒置顯微鏡及AO染色顯示，細(xì)胞死亡減少，細(xì)胞皺縮減輕，突起變長(zhǎng)，凋亡程度減輕，流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡率降低，分別為19.38±3.20％和33.24±2.32％，與相對(duì)應(yīng)的6-OHDA組相比較，P＜0.05。 結(jié)論：DβHB對(duì)6-OHDA引起的PC12細(xì)胞凋亡有抑制作用。 第三部分 DβHB對(duì)6-O

11、HDA引起的PC12細(xì)胞bcl-2/bax mRNA表達(dá)及caspase-3活性變化的影響 目的：研究DβHB對(duì)6-OHDA引起的PC12細(xì)胞bcl-2/bax mRNA表達(dá)及caspase-3活性變化的影響。 方法：細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理及分組同第二部分。用RT-PCR方法檢測(cè)bcl-2mRNA和bax mRNA表達(dá)情況并計(jì)算bcl-2/bax mRNA比值，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)caspase-3活性的變化。 結(jié)果：

12、半定量RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，6-OHDA(終濃度為50和100μM)引起了bcl-2 mRNA表達(dá)降低，bax mRNA表達(dá)升高，bcl-2/bax mRNA比值降低，與對(duì)照組相比較，P＜0.05。caspase-3活性升高，為對(duì)照組的125.83±1.54％和146.27±2.41％，與對(duì)照組相比較，P＜0.05。給予DβHB(終濃度為4mM)預(yù)處理的PC12細(xì)胞經(jīng)6-OHDA處理24h后，bcl-2 mRNA升高，baxmRNA

13、降低，bcl-2/bax mRNA比值升高，與相對(duì)應(yīng)的6-OHDA組相比較，P＜0.05。caspase-3活性降低，為對(duì)照組的115.61±2.75％和132.75±3.11％，與相對(duì)應(yīng)的6-OHDA組相比較，P＜0.05。 結(jié)論：6-OHDA引起了PC12細(xì)胞bcl-2/bax mRNA比值表達(dá)降低，caspase-3活性升高，DβHB對(duì)上述變化具有抑制作用。 第四部分DβHB對(duì)6-OHDA引起的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激

14、的影響 目的：觀察DβHB對(duì)6-OHDA引起的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。 方法：細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理及分組同第二部分。用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA和細(xì)胞內(nèi)GSH含量的變化。 結(jié)果：6-OHDA(終濃度為50和100μM)引起了PC12細(xì)胞內(nèi)ROS升高，分別為對(duì)照組的167.69±9.40％和289.8±9.42％，與對(duì)照組相比較，P＜0.05；MDA升高，分別為對(duì)照組的201.24±9.68％和29

15、1.18±17.59％，與對(duì)照組相比較，P＜0.05：細(xì)胞內(nèi)GSH降低，分別為對(duì)照組的75.45±4.97％和53.98±3.20％，與對(duì)照組相比較，P＜0.05。給予DβHB(終濃度為4mM)預(yù)處理的PC12細(xì)胞經(jīng)6-OHDA處理24h后，細(xì)胞內(nèi)ROS降低，分別為對(duì)照組的155.57±6.32％和275.53±8.28％，與相對(duì)應(yīng)的6-OHDA組相比較，P＜0.05；MDA降低，分別為對(duì)照組的156.33±9.07％和220.37±1

16、9.81％，與相對(duì)應(yīng)的6-OHDA組相比較，P＜0.05：細(xì)胞內(nèi)GSH升高，分別為對(duì)照組的82.29±0.78％和61.01±4.36％，與相對(duì)應(yīng)的6-OHDA組相比較，P＜0.05。 結(jié)論：DβHB對(duì)6-OHDA引起的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激具有抑制作用。 第五部分DβHB對(duì)6-OHDA引起的PC12細(xì)胞線粒體功能障礙的影響 目的：觀察DβHB對(duì)6-OHDA引起的PC12細(xì)胞線粒體功能障礙的影響。 方法：細(xì)

17、胞培養(yǎng)、藥物處理及分組同第二部分。多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)線粒體膜電位和ATP水平變化情況。 結(jié)果：6-OHDA(終濃度為50和100μM)引起了PC12細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降，為對(duì)照組的78.81±2.96％和42.01±2.95％，具有濃度依賴性，與對(duì)照組相比較，P＜0.05;ATP生成減少，為對(duì)照組的62.23±4.46％和32.2±4.37％，具有濃度依賴性，與對(duì)照組相比較，P＜0.05。給予DβHB(終濃度為4mM)預(yù)處理1