產(chǎn)Il-9T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)及Smad3-Smad4信號的作用.pdf

1、目的:
　　探討誘導(dǎo)初始型T細(xì)胞向產(chǎn)IL-9 T細(xì)胞分化的條件，建立體外誘導(dǎo)Th9細(xì)胞的方法;觀察在選定的誘導(dǎo)條件下細(xì)胞分化過程中可能發(fā)生的類型轉(zhuǎn)化，以及相關(guān)細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子的變化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　方法:
　　(1)MACS法分選初始型T細(xì)胞:無菌條件下，取6-8周齡雌性Balb/c小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液后通過磁珠分選出CD4+CD62L+初始型T細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析其表面分子CD4以檢測分選效率。
　

2、　(2)產(chǎn)IL-9 T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和鑒定:分選得到的初始型T細(xì)胞用抗CD3和抗CD28激活，繼后分別用不同濃度的IL-4和TGF-β誘導(dǎo)分化，5天后在經(jīng)PE標(biāo)記的IL-9 McAb和Per-cy5.5標(biāo)記的IL-4 McAb進(jìn)行胞內(nèi)雙色熒光染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析不同濃度的IL-4和TGF-β對產(chǎn)IL-9 T細(xì)胞誘導(dǎo)的影響。
　　此外，分析不同誘導(dǎo)時(shí)間對產(chǎn)IL-9T細(xì)胞誘導(dǎo)的影響，即選擇不同濃度的IL-4和TGF-β，分別刺激初

3、始型T細(xì)胞不同時(shí)間，同樣用流式細(xì)胞技術(shù)分析誘導(dǎo)結(jié)果。
　　(3)qRT-PCR法檢測相關(guān)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)水平:在本試驗(yàn)確定的最佳IL-4、TGF-β濃度條件下，對初始T細(xì)胞以不同時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)分化。收集誘導(dǎo)的細(xì)胞，提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后行qRT-PCR法，檢測IL-4、IL-9、PU.1、IRF-4和GATA-3等細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。
　　(4)TGF-β信號通路重要分子Smad2、Smad3、Sma

4、d4等表達(dá)水平的測定:初始型T細(xì)胞相繼經(jīng)抗CD3和抗CD28激活和經(jīng)IL-4和TGF-β誘導(dǎo)不同時(shí)間后，收集細(xì)胞做qRT-PCR檢測，分析TGF-β信號通路重要分子Smad2、Smad3和Smad4的表達(dá)水平。
　　(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:通過GraphPad Prism5軟件對流式結(jié)果做出相應(yīng)線性圖;應(yīng)用GraphPad Prism5對定量結(jié)果做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間的均數(shù)比較首先進(jìn)行組間的方差齊性分析(Levene' test)，方差齊

5、采用非配對t檢驗(yàn)，方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)30 ng/ml IL-4和5 ng/ml TGF-β作用5天，即為本研究確定的誘導(dǎo)產(chǎn)IL-9 T細(xì)胞的最佳條件。在初始型T細(xì)胞分化為產(chǎn)IL-9 T細(xì)胞的過程中，可見誘導(dǎo)5天時(shí)產(chǎn)IL-9T比例隨著IL-4濃度升高而增加，而利于產(chǎn)IL-9T細(xì)胞分化的TGF-β濃度以5 ng/ml為最佳，高或低于此濃度均不能有效地促進(jìn)此類細(xì)胞的分化

6、。
　　(2)產(chǎn)IL-9 T細(xì)胞分化過程經(jīng)歷IL-4+T細(xì)胞過渡階段。初始型T細(xì)胞在不同濃度IL-4(10 ng/ml、30 ng/ml)和TGF-β(2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)的培養(yǎng)條件下，于第3天首先分化為IL-4+T細(xì)胞，而第5天則分化為IL-9+T細(xì)胞。這一結(jié)果表明，在本研究采用的誘導(dǎo)條件下，Th9細(xì)胞的分化呈現(xiàn)從IL-4+T到IL-9+T分化的時(shí)序性。提示初始型T細(xì)胞分化為Th9細(xì)胞可能需要經(jīng)歷T

7、h2細(xì)胞過渡階段，擬或Th2細(xì)胞也可直接誘導(dǎo)為IL-9+T或Th9細(xì)胞。
　　(3)qRT-PCR結(jié)果表明，在選定的最佳誘導(dǎo)條件下，初始型T細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后于第3天和第5天時(shí)細(xì)胞因子IL-4和IL-9的表達(dá)水平與此時(shí)的細(xì)胞類型一致。在誘導(dǎo)的第5天和第3天相比，Pu.1(Sfpi1)表達(dá)有所下降而Irf4表達(dá)則升高，Gata3無明顯改變。
　　(4)TGF-β通路的信號分子Smad3和Smad4表達(dá)明顯上調(diào)。qRT-PCR分析結(jié)果

8、表明，初始型T細(xì)胞在30 ng/ml IL-4和5 ng/ml TGF-β刺激5天時(shí)，Smad3和Smad4的表達(dá)升高且明顯高于誘導(dǎo)的第3天，而Smad2的表達(dá)則無明顯改變。
　　結(jié)論:
　　體外，抗CD3和抗CD28預(yù)先激活的初始型T細(xì)胞，在IL-4(30 ng/ml)和TGF-β(5ng/ml)存在的條件下，經(jīng)5天的時(shí)間可誘導(dǎo)出產(chǎn)IL-9T細(xì)胞;在誘導(dǎo)過程中經(jīng)歷了IL-4+T細(xì)胞過渡階段，呈現(xiàn)從IL-4+T到IL-9+T