蛋白多糖在腦組織細(xì)胞缺血缺氧炎性反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用及其調(diào)控機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察蛋白多糖在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損害和大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷的炎性反應(yīng)中的作用及其調(diào)控機(jī)理，為缺血性腦血管疾病的抗炎治療尋找新的靶點(diǎn)。 方法： 1．建立人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，給予HEEL、GAG、heparinase、Sdc—lab、Sdc-3Ab、CAP37Ab預(yù)培養(yǎng)6h，然后再予以常氧環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)和缺氧2h／復(fù)氧2h處理。 2．建立大鼠腦皮質(zhì)微

2、血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，給予HEEL、GAG、heparinase、Sdc一1Ab、Sdc-3Ab、CAP37Ab預(yù)培養(yǎng)6h，然后再予以常氧環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)和缺氧2h／復(fù)氧2h處理。 3．建立大鼠星型神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)，給予HEEL、GAG、heparinase、Sdc—lAb、Sdc-3Ab、CAP37Ab預(yù)培養(yǎng)6h，然后再予以常氧環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)和缺氧2h／復(fù)氧2h處理。 以上各組又分為正常對(duì)照組(即不處理)和各不同干預(yù)組。

3、 4．建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞腦缺血模型(MCAO)，隨機(jī)分為假手術(shù)組和缺血2h／再灌注4、24、72h和7d組，造模成功后分別進(jìn)行生理鹽水、HEEL和GAG尾靜脈注射處理。 5．人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞活力(MTT法)檢測(cè)。 6．應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)粘結(jié)合蛋白多糖一1(syndecan．1)、粘結(jié)合蛋白多糖一3(syndecan-3)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶(ERK2)和肝磷脂結(jié)合蛋白(azurocidin,CAP37

4、)的表達(dá)。 7．應(yīng)用原位雜交檢測(cè)ERK2mRNA；應(yīng)用ELISA檢測(cè)單核細(xì)胞一巨噬細(xì)胞刺激克隆因子。 8．應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)syndecan一1mRNA和CAP37mRNA的表達(dá)；應(yīng)用westernblot檢測(cè)syndecan一1和CAP37蛋白質(zhì)的表達(dá)。 9．測(cè)定大鼠局灶性缺血／再灌注各干預(yù)組在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)(4h、24h、72h、7d)神經(jīng)功能缺失體征和病理改變。 結(jié)果： 1．常氧條件下，人臍

5、靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)照組和各干預(yù)組細(xì)胞活力表達(dá)基本正常，無(wú)顯著差異；缺氧／復(fù)氧處理后，對(duì)照組細(xì)胞活力明顯下降，各干預(yù)組細(xì)胞活力明顯上調(diào)，組間無(wú)明顯差異。 2．人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在常氧條件下培養(yǎng)，syndecan-1有陽(yáng)性表達(dá)，缺氧復(fù)氧后表達(dá)明顯上調(diào)；常氧條件培養(yǎng)，HEEL、GAG、heparinase、Sdc一1Ab、Sdc-3Ab和CAP37Ab組均能明顯上調(diào)syndecan．1；缺氧復(fù)氧培養(yǎng)，HEEL、GAG、heparin

6、ase、Sdc—lab、Sdc-3Ab和CAP37Ab組能明顯上調(diào)syndecan一1，其中heparinase、Sdc一1Ab、Sdc-3Ab和CAP37Ab上調(diào)作用更明顯。 3．人臍靜脈血管內(nèi)細(xì)胞常氧條件下培養(yǎng)，對(duì)照組CAP37有陽(yáng)性表達(dá)，缺氧復(fù)氧對(duì)照組CAP37表達(dá)有輕微上調(diào)；常氧條件培養(yǎng)，HEEL和CAP37Ab能輕微上調(diào)CAP37的表達(dá)，heparinase能輕度下調(diào)，余組與對(duì)照組表達(dá)相似；缺氧復(fù)氧處理后，各干預(yù)組與常

7、氧組相比，都能上調(diào)CAP37表達(dá)，其中HEEL和CAP37Ab更明顯。 4．人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞常氧條件下，對(duì)照組和各干預(yù)組syndecan-3有輕微弱陽(yáng)性表達(dá)；缺氧／復(fù)氧處理后，heparinase、Sdc—lab、Sdc-3Ab和CAP37Ab能輕度上調(diào)syndecan-3，而HEEL和GAG作用不明顯。 5．人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞常氧下，對(duì)照組ERK2表達(dá)陽(yáng)性，缺氧／復(fù)氧對(duì)照組ERK2有輕度上調(diào)；常氧條件培養(yǎng)，各干預(yù)

8、組都有陽(yáng)性表達(dá)，其中heparinase和CAP37Ab有輕度上調(diào)；缺氧復(fù)氧處理，各干預(yù)組都能明顯上調(diào)ERK2表達(dá)，但GAG、heparinase和CAP37Ab作用更明顯。 6．人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞常氧培養(yǎng)上清液對(duì)照組GM-CSF表達(dá)正常，缺氧復(fù)氧對(duì)照組GM-CSF明顯上調(diào)；常氧培養(yǎng)HEEL、GAG、heparinase和CAP37Ab組GM-CSF與常氧對(duì)照組相比表達(dá)明顯下調(diào)，而Sdc．1Ab和Sdc-3Ab不明顯；缺氧復(fù)氧

9、處理HEEL、GAG、heparinase和CAP37Ab組與缺氧對(duì)照組相比GM-CSF表達(dá)明顯下調(diào)，而Sdc一1Ab和Sdc-3Ab不明顯。 7．大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞常氧條件，對(duì)照組syndecan一1有陽(yáng)性表達(dá)，缺氧復(fù)氧對(duì)照組有輕度上調(diào)；常氧培養(yǎng)各干預(yù)組能輕度上調(diào)syndecan一1；缺氧復(fù)氧處理后，各組都能上調(diào)syndecan—l表達(dá)，其中GAG、Sdc一1Ab、Sdc-3Ab和CAP37Ab上調(diào)作用更明顯。

10、8．大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞常氧培養(yǎng)對(duì)照組CAP37有陽(yáng)性表達(dá)，缺氧復(fù)氧對(duì)照組有明顯上調(diào)；常氧條件培養(yǎng)各干預(yù)組都能上調(diào)CAP37表達(dá)，缺氧復(fù)氧處理各干預(yù)組與常氧條件下各組相比能明顯上調(diào)CAP37表達(dá)。 9．大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞常氧培養(yǎng)對(duì)照、HEEL、GAG和heparinase組syndecan-3表達(dá)弱，而Sdc一1Ab、Sdc-3Ab和CAP37表達(dá)有輕微陽(yáng)性；缺氧／復(fù)氧處理后對(duì)照組和干預(yù)組均能上調(diào)syndecan-3表

11、達(dá)，但HEEL、GAG和CAP37Ab作用更明顯。 1O．大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞常氧培養(yǎng)對(duì)照組和干預(yù)組都有ERK2陽(yáng)性表達(dá)，缺氧復(fù)氧處理后對(duì)照組和干預(yù)組都能上調(diào)ERK2的陽(yáng)性表達(dá)，其中HEEL、GAG和heparinase上調(diào)作用更明顯。 11．大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞常氧培養(yǎng)上清液對(duì)照組GM-CSF表達(dá)正常，缺氧復(fù)氧對(duì)照組GM-CSF明顯上調(diào)；常氧培養(yǎng)HEEL、GAG、heparinase和CAP37Ab組GM-CS

12、F與常氧對(duì)照組相比表達(dá)明顯下調(diào)，而Sdc一1Ab和Sdc-3Ab不明顯；缺氧復(fù)氧處理HEEL、GAG、heparinase和CAP37Ab組與缺氧對(duì)照組相比GM-CSF表達(dá)明顯下調(diào)，而Sdc．1Ab和Sdc-3Ab不明顯。 12．大鼠腦星型膠質(zhì)細(xì)胞常氧培養(yǎng)對(duì)照組和各干預(yù)組syndecan一1陽(yáng)性表達(dá)不明顯；缺氧復(fù)氧處理后對(duì)照組和干預(yù)組syndecan-1陽(yáng)性表達(dá)也不明顯。 13．大鼠腦星型膠質(zhì)細(xì)胞常氧培養(yǎng)對(duì)照組CAP37

13、有陽(yáng)性表達(dá)，缺氧／復(fù)氧處理對(duì)照組CAP37表達(dá)有上調(diào)；常氧條件下培養(yǎng)，各干預(yù)組均能上調(diào)CAP37，但GAG和heparinase作用更明顯；缺氧／復(fù)氧處理后，各干預(yù)組與常氧各組和缺氧復(fù)氧對(duì)照組相比均能上調(diào)CAP37表達(dá)，但HEEL、GAG和heparinase組更明顯。 14．大鼠腦星型膠質(zhì)細(xì)胞常氧培養(yǎng)對(duì)照組和各干預(yù)組syndecan-3陽(yáng)性表達(dá)不明顯；缺氧復(fù)氧處理后對(duì)照組和干預(yù)組syndecan-3陽(yáng)性表達(dá)也不明顯。

14、15．大鼠腦星型膠質(zhì)細(xì)胞常氧培養(yǎng)對(duì)照組和干預(yù)組ERK2有陽(yáng)性表達(dá)，缺氧復(fù)氧處理后對(duì)照組和干預(yù)組ERK2陽(yáng)性表達(dá)有上調(diào)，其中HEEL和GAG組作用更明顯。 16．大鼠腦星型膠質(zhì)細(xì)胞常氧培養(yǎng)上清液對(duì)照組GM-CSF表達(dá)正常，缺氧培養(yǎng)對(duì)照組GM-CSF表達(dá)增加；常氧條件培養(yǎng)HEEL、GAG和heparinase組能明顯降低GM-CSF表達(dá)，而其余各組與對(duì)照組表達(dá)相同；缺氧復(fù)氧處理后，與缺氧對(duì)照組相比HEEL、GAG和heparinas

15、e組能明顯下調(diào)GM-CSE而其余各干預(yù)組GM-CSF上調(diào)明顯。 17．大鼠MCAO后，HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明顯改善神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分，HEEL和GAG組間無(wú)差異。 18．大鼠MCAO后，HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明顯減少局灶性腦缺血／再灌注損傷病灶炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，HEEL和GAG組間無(wú)差異。 19．大鼠MCAO后，HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明

16、顯增加局灶性腦缺血／再灌注損傷周圍帶syndecan一1的表達(dá)，HEEL和GAG組問(wèn)無(wú)差異。 20．大鼠MCAO后，HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明顯增加局灶性腦缺血／再灌注損傷周圍帶ERK2的表達(dá)，并增加ERK2的表達(dá)時(shí)間，在72h和7d觀察時(shí)間點(diǎn)還可見(jiàn)ERK2的表達(dá)。HEEL和GAG兩組間作用無(wú)差異。 21．大鼠MCAO后，RT-PCR檢測(cè)顯示HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明顯增加

17、局灶性腦缺血／再灌注損傷周圍帶syndecan一1mRNA和CAP37mRNA的表達(dá)。HEEL和GAG兩組間作用無(wú)差異。 22．大鼠MCAO后，ELISA檢測(cè)顯示HEEL和GAG組與缺血／再灌注生理鹽水組相比能明顯減少局灶性腦缺血／再灌注損傷周圍帶GM-CSF的表達(dá)。而且HEEL降低GM-CSF比GAG更明顯，兩組間也有明顯差異。 結(jié)論：蛋白多糖(syndecan一1、syndecan-3、CAP37)在腦組織細(xì)胞的缺血