HIF-1α長(zhǎng)效抑制載體的構(gòu)建及對(duì)食管癌細(xì)胞光動(dòng)力效應(yīng)的影響.pdf

1、背景：食管癌是我國(guó)消化道惡性腫瘤之一,死亡人數(shù)約占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的1／4,居惡性腫瘤死亡率第四位,僅次于肝癌,肺癌,和胃癌。目前認(rèn)為早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是提高食管癌治療效果的關(guān)鍵。早期治療中臨床手術(shù)治療是食管癌的主要治療手段之一,但切除后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響了食管癌患者的治愈率和生存率。放療和化療雖療效肯定,但其副作用嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。光動(dòng)力學(xué)療法(Photodynamic therapy,PDT)利用光敏劑和合適波

2、長(zhǎng)的光,近20多年已應(yīng)用于許多腫瘤的臨床治療,包括食管癌癌前病變、早期癌根治治療,晚期癌姑息性治療。但是仍存在許多患者對(duì)PDT應(yīng)答的敏感性低下,并已成為臨床食管癌光動(dòng)力治療的難題之一,因此弄清影響食管癌光動(dòng)力學(xué)療效的因素及其作用機(jī)制將有助于尋找提高PDT臨床療效的新方法和新思路并針對(duì)不同腫瘤患者制定合理的個(gè)體化治療方案,從而提高患者療后生存率。
　　 以往的研究提示多種因素能夠影響PDT效果,這些因素除所選用的光敏劑、光波長(zhǎng)和氧

3、分子以外,還包括腫瘤細(xì)胞的生物性狀(如細(xì)胞分化狀態(tài))、機(jī)體的免疫狀態(tài)、細(xì)胞內(nèi)某些促凋亡基因和抑凋亡基因的表達(dá)水平與活性水平等。由于光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)需依賴(lài)分子氧的存在,氧分子的缺乏能夠?qū)е聠螒B(tài)氧產(chǎn)量不足,因而PDT效果下降。但在多數(shù)實(shí)體腫瘤中往往存在低氧狀態(tài)。實(shí)體瘤組織的缺氧導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的泛素介導(dǎo)蛋白酶體降解過(guò)程受到抑制,細(xì)胞內(nèi)水平增加。HIF-1α作為一種轉(zhuǎn)錄因子,能激活多種基因的表達(dá),如促紅細(xì)胞生成素(EPO)、

4、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、多藥耐藥基因(MDR1),還有一些與能量代謝有關(guān)的酶類(lèi),均與細(xì)胞存活、增殖、血管生成、侵襲、耐藥等相關(guān),因而HIF-1α有可能影響到臨床PDT的療效。除此之外,據(jù)報(bào)道證實(shí)HIF-1α也與細(xì)胞凋亡相關(guān),由于PDT對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的重要機(jī)制之一就是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,推測(cè)HIF-1α的表達(dá)水平有可能影響到PDT的殺傷效應(yīng),因而蛋白HIF-1α的表達(dá)狀況對(duì)PDT效應(yīng)的影響及其作用機(jī)制是我們研究的重要內(nèi)容之一。
　　

5、 本研究利用化學(xué)誘導(dǎo)法建立食管癌細(xì)胞缺氧模型,并構(gòu)建能長(zhǎng)效抑制蛋白HIF-1α表達(dá)的抑制載體,了解蛋白HIF-1α表達(dá)與食管鱗癌細(xì)胞PDT效應(yīng)的關(guān)系,觀(guān)察HIF-1α蛋白抑制后對(duì)PDT細(xì)胞殺傷功能的影響,為臨床上通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)而提高PDT的療效奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 本研究共分為以下兩部分:第一部分,長(zhǎng)效抑制HIF-1α表達(dá)載體的構(gòu)建鑒定和穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。第二部分,干擾HIF-1α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)的

6、影響。
　　 目的：
　　 1,構(gòu)建HIF-1α shRNA抑制載體,通過(guò)細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法建立長(zhǎng)效抑制HIF-1α蛋白表達(dá)的食管鱗癌EC-9706細(xì)胞株,為研究其影響PDT效應(yīng)的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 2,觀(guān)察化學(xué)法誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)和干擾HIF-1α蛋白表達(dá)后對(duì)常氧條件培養(yǎng)的食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖的影響。
　　 3,研究蛋白HIF-1α誘導(dǎo)表達(dá)及阻斷HIF-1α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞PDT處理

7、后的細(xì)胞存活率與細(xì)胞凋亡率,明確HIF-1α的表達(dá)與食管鱗癌光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)siRNA干擾原理,利用WHITEHOUSE和siDirect在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件以及Rational siRNA Design軟件設(shè)計(jì)siRNA干擾序列。
　　 2.根據(jù)載體插入位點(diǎn)將siRNA干擾序列轉(zhuǎn)換為shRNA序列；將設(shè)計(jì)成功的干擾序列連入pENTRTM／H1／TO載體和pEZsiRNA6.1載體。

8、r>　　 3.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建得到的有效干擾質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入食管鱗癌細(xì)胞(EC-9706細(xì)胞)中,應(yīng)用倒置熒光顯微鏡的觀(guān)察,蛋白印跡法確定蛋白干擾效果。
　　 4.利用MTT法檢測(cè)抑制HIT-1α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞常氧時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài);對(duì)比觀(guān)察HIF-1α誘導(dǎo)表達(dá)及抑制誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞在PDT處理后的細(xì)胞存活率。
　　 5.利用流式細(xì)胞法檢測(cè)干擾HIF-1α蛋白表達(dá)前后細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　

9、 1.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及western blot結(jié)果表明設(shè)計(jì)的siRNA序列能夠明顯抑制HIF-1α蛋白的表達(dá)；以此siRNA序列設(shè)計(jì)出shRNA序列,連接載體,PCR和測(cè)序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEZsiRNA6.1-hif-105；以此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞系,熒光顯微鏡觀(guān)察和western blot鑒定結(jié)果表明成功得到能抑制HIF-1α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　 2.化學(xué)誘導(dǎo)法成功建立了食管鱗癌缺氧細(xì)胞模型;常氧條件培

10、養(yǎng)穩(wěn)定細(xì)胞,干擾HIF-1α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)組和未干擾HIF-1α蛋白誘導(dǎo)表達(dá)組細(xì)胞增殖曲線(xiàn)基本一致,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 3.細(xì)胞CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)后,PDT處理,干擾HIF-1α蛋白表達(dá)組(EC-9706-pEZsiRNA6.1-hif-105細(xì)胞)與未干擾HIF-1α蛋白表達(dá)組(EC-9706-pEZsiRNA6.1-neg細(xì)胞)細(xì)胞存活率分別為69.27％±5.21和88.36％±2.81,有顯著性差異(P<

11、0.01),表明HIF-1α蛋白的表達(dá)抑制了PDT作用效果。
　　 4.流式檢測(cè)PDT后的細(xì)胞凋亡,EC-9706-pEZsiRNA6.1-hif-105細(xì)胞組與EC-9706-pEZsiRNA6.1-neg細(xì)胞組早期凋亡率分別為29.31±2.75％和13.99±0.89％,有顯著性差異(P<0.05),提示HIF-1α蛋白抑制PDT對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,至少部分是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)。
　　 結(jié)論：