ODC和AdoMetDC雙反義腺病毒載體對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究目的: 多胺是存在于所有生物中脂肪族多聚離子，主要包括腐胺（Put），精脒（Spd）和精胺（Spm）。是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要物質(zhì)，它可以通過改變DNA結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑等方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞周期的維持也需要多胺的合成。鳥氨酸脫梭酶（ODC）和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（AdoMetDC）是多胺生物合成的的關(guān)鍵酶。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為多胺的過度生成與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。如果能有效減弱多胺在腫瘤

2、細(xì)胞中的過度表達(dá)，則可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因而研究抑制多胺合成的關(guān)鍵酶的方法就成了進(jìn)來(lái)癌癥治療的熱點(diǎn)。本研究在成功構(gòu)建并擴(kuò)增出ODC和AdoMetDC雙反義RNA腺病毒載體的基礎(chǔ)之上，研究鳥氨酸脫羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶雙反義腺病毒對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究食管癌基因治療的方法提供理論依據(jù)和技術(shù)對(duì)策。 研究方法: ①構(gòu)建鳥氨酸脫羧酶（ODC）和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（AdoMetDC）雙反義RNA腺病毒載體

3、。 ②重組腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas感染效率的測(cè)定。采用FACS檢測(cè)Ad-GFP感染細(xì)胞中GFP表達(dá)，以測(cè)定不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的腺病毒對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率。酶標(biāo)儀（BIO-RAD Model 680）測(cè)定570nm處的吸光值。 ③應(yīng)用MTT法實(shí)驗(yàn)觀察Ad-ODC-AdoMetDCas對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。測(cè)定被不同感染復(fù)數(shù)重組腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas感

4、染細(xì)胞的增殖程度，并繪制不同感染細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 ④采用Western印跡檢測(cè)Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒（Ad-ODC-AdoMetDCas）后，其ODC和AdoMetDC蛋白表達(dá)的量。將食管癌Eca109細(xì)胞分別感染50 MOI的Ad-GFP，Ad-ODCas和Ad-ODC-AdoMetDCas 72 h后收集細(xì)胞。用裂解液抽提細(xì)胞總蛋白。蛋白樣品濃度采用BCA法測(cè)定。 ⑤采用HPLC法檢測(cè)食管癌Eca109細(xì)胞胞轉(zhuǎn)染

5、腺病毒（Ad-ODC-AdoMetDCas）后，其多胺的含量。收集107個(gè)細(xì)胞，用PBS沖洗兩遍后離心。將高氯酸加入到細(xì)胞沉淀中離心，取上清液。用HPLC系統(tǒng)測(cè)定多胺的含量。 ⑥應(yīng)用TUNEL標(biāo)記檢測(cè)法觀察Ad-ODC-AdoMetDCas對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞凋亡的影響。腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas，Ad-ODCas和Ad-GFP分別以50MOI感染ECA109細(xì)胞后，用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

6、 ⑦應(yīng)用透射電鏡進(jìn)一步觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 研究結(jié)果: ①基因轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以50MOI的Ad-GFP感染食管癌Eca109細(xì)胞48h后，大約有75％食管癌Eca109細(xì)胞GFP表達(dá)陽(yáng)性，但不會(huì)引起細(xì)胞毒性。 ②重組腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞有劑量依賴性的抑制作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果挑選食管癌Eca109細(xì)胞的感染滴度為50MOI。正常情況下食管癌Eca109細(xì)胞生長(zhǎng)迅

7、速，而感染Ad-ODC-AdoMetDCas后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線更趨低平，最大生長(zhǎng)抑制率可達(dá)70％，而無(wú)明顯細(xì)胞毒性。 ③采用Western印跡法顯示以Ad-ODC-AdoMetDCas感染食管癌Eca109細(xì)胞，可明顯抑制食管癌Eca109細(xì)胞中ODC和AdoMetDC基因表達(dá)，ODC和AdoMetDC含量明顯減少。 ④HPLC結(jié)果顯示，食管癌Eca109細(xì)胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后，細(xì)胞內(nèi)

8、三種多胺含量都明顯降低（p<0．05）。 ⑤TUNEL標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，Ad-ODC-AdoMetDCas可引起食管癌Eca109細(xì)胞明顯凋亡。 ⑥透射電鏡下可見，典型的細(xì)胞凋亡特征，表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，核皺縮、碎裂，染色質(zhì)呈塊狀邊集等。 研究結(jié)論: ODC和AdoMetDC雙反義腺病毒載體（Ad-ODC-AdoMetDCas）能顯著抑制食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，降低細(xì)胞多胺合成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為探討食管癌基因