冬凌草質(zhì)量控制與二萜類成分藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、冬凌草為唇形科香茶菜屬植物碎米椏(Isodon rubescens(Hemsl．)Hara)的干燥地上部分，以草質(zhì)部分入藥。廣泛分布于我國黃河長江流域，主產(chǎn)于河南濟(jì)源太行山一帶。味甘苦，性微寒，具有清熱解毒、消炎止痛、健胃活血及抗腫瘤之功效。民間常常用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎、蛇蟲咬傷，并對(duì)食管癌、賁門癌、原發(fā)性肝癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌等有一定療效，對(duì)食管上皮增生有顯著療效。植物研究證實(shí)冬凌草含有二萜、黃酮、酚酸、三萜和揮發(fā)油等化學(xué)

2、成分。目前已有冬凌草用于抗癌的片劑和治療咽痛的含片應(yīng)用于臨床。二萜是冬凌草中一種主要的藥效活性成分，但由于種類多樣且含量較低，使其深入研究受到限制。然而對(duì)于冬凌草的大量研究僅處在提取分離階段，而對(duì)其質(zhì)量控制方法和藥物代謝動(dòng)力學(xué)方面的研究卻很少。
　　 本文通過對(duì)冬凌草進(jìn)行系統(tǒng)分離，確定其中的化學(xué)成分，采用LC-MS作為主要分析方法，利用其快速高效、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)冬凌草中的微量和痕量物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，并推斷其中

3、的未知成分。同時(shí)研究二萜類成分在動(dòng)物體內(nèi)的過程和代謝規(guī)律研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用二萜類有效成分提供技術(shù)支持。
　　 第一部分冬凌草化學(xué)成分的研究
　　 目的：本研究以冬凌草乙酸乙酯和正丁醇部分為研究對(duì)象，利用硅膠柱色譜、制備薄層色譜、高效液相制備色譜以及重結(jié)晶等分離純化技術(shù)對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分離研究，并應(yīng)用MS、1H-NMR、13C-NMR現(xiàn)代化手段完成單體化合物分子的結(jié)構(gòu)鑒定，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。
　　 方法：干

4、燥的冬凌草(10Kg)適當(dāng)粉碎后，用95％乙醇冷浸3次，合并浸出液加熱，加入活性炭趁熱抽濾，濾液減壓濃縮至粘膏狀(340g)，將其懸浮于飽和NaCl水溶液中，分別用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，繼而得到石油醚部位(89)、三氯甲烷部位(32g)和乙酸乙酯部位(48g)、正丁醇部位(36g)。本研究先后對(duì)乙酸乙酯部位和正丁醇部位采用硅膠柱色譜進(jìn)行初步分離，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)后，進(jìn)一步用硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜，制備薄層色譜、高效

5、液相制備色譜反復(fù)分離純化得到單體化合物。運(yùn)用1H-NMR、13C-NMR波譜學(xué)方法對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。
　　 結(jié)果：冬凌草通過系統(tǒng)提取分離，從中得到7個(gè)單體化合物，其中包括1個(gè)二萜類化合物，5個(gè)酚酸，1個(gè)甾醇：冬凌草甲素，咖啡酸，阿魏酸，原兒茶醛，水楊酸，綠原酸，β-谷甾醇。
　　 結(jié)論：本文對(duì)冬凌草的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，所選用的提取方法及提取溶劑適當(dāng)，采用了硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜、制備薄層色譜、制

6、備液相色譜等分離手段，共分離得到7個(gè)化合物，并且運(yùn)用多種現(xiàn)代波譜手段及其相關(guān)知識(shí)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，其中包括1個(gè)二萜類化合物，5個(gè)酚酸，1個(gè)甾醇：冬凌草甲素，咖啡酸，阿魏酸，原兒茶醛，水楊酸，綠原酸，β-谷甾醇，其中綠原酸為首次從該植物中提取分離得到。
　　 第二部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定冬凌草中的二萜類成分
　　 目的：總結(jié)貝殼杉烷型二萜類成分的電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律，建立靈敏、有效的可用于鑒定冬凌草中二萜類成分的液質(zhì)聯(lián)用(LC-M

7、S)分析方法。
　　 方法：通過電噴霧離子源負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜掃描、母離子掃描和子離子掃描，研究16個(gè)二萜類成分對(duì)照品的質(zhì)譜裂解途徑，并總結(jié)其規(guī)律，進(jìn)而聯(lián)合采用多離子監(jiān)測(cè)-信息依賴-增強(qiáng)型子離子掃描(MIM-IDA-EPI)和中性粒子缺失-信息依賴-增強(qiáng)型子離子掃描(NL-IDA-EPI)兩種模式分析鑒定冬凌草中二萜類化合物。采用C18柱進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為0.1％甲酸水·甲醇，梯度洗脫。
　　 結(jié)果：總結(jié)出7個(gè)二萜類成分

8、的質(zhì)譜裂解規(guī)律和相同構(gòu)型且含有相同取代基的同分異構(gòu)體在RP-HPLC上的洗脫順序規(guī)律。據(jù)此鑒定出冬凌草提取物中40個(gè)二萜類成分。
　　 結(jié)論：本法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，成功用于冬凌草中二萜類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MIM-IDA-EPI和NL-IDA-EPI掃描模式聯(lián)用技術(shù)在化合物結(jié)構(gòu)分析方面具有超過其單一模式的優(yōu)越性，對(duì)控制中藥材質(zhì)量具有重要意義。
　　 第三部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定冬凌草中28種成分及冬凌草質(zhì)量表征

9、
　　 目的：建立一種快速、準(zhǔn)確、可同時(shí)測(cè)定冬凌草中28種化學(xué)成分(19種二萜類成分、6種酚酸及3種黃酮)的HPLC-ESI-MS分析方法，并用于冬凌草藥材分析及質(zhì)量調(diào)查。
　　 方法：取冬凌草藥材粉末約1.0g，精密稱定，加入25mL甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理60min，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)充減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，進(jìn)樣測(cè)定。由MRM-IDA-EPI模式對(duì)28種化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，采用

10、MRM正負(fù)離子掃描模式建立其含量測(cè)定方法，并采用所建立的方法對(duì)不同產(chǎn)地的21批冬凌草藥材進(jìn)行分析。質(zhì)譜條件：ESI源；正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)；源噴射電壓(IS):5500V（正離子監(jiān)測(cè)模式），-4500V（負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式）；離子源溫度：600℃。霧化氣(Gasl)：40psi，加熱氣（Gas2）：50psi，簾氣：25psi。色譜條件：色譜柱：DiamonsilC18column(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：0.1

11、％甲酸-甲醇（含0.1％甲酸），梯度洗脫；分析時(shí)間：15.1min;流速：0.7mL·min-1，進(jìn)樣量10μL。
　　 結(jié)果：28種化學(xué)成分在測(cè)定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限和定量限均符合要求。樣品測(cè)定結(jié)果表明，冬凌草產(chǎn)地、生長環(huán)境和采集時(shí)間均對(duì)28種活性成分的含量有影響，其中產(chǎn)地時(shí)間和生長環(huán)境是其中較為重要的影響因素。
　　 結(jié)論：本法簡(jiǎn)便、快速、專屬性好，可用于冬凌草中28種化學(xué)成分的含量

12、測(cè)定，除冬凌草甲素和冬凌草乙素外，其他17種二萜均為首次測(cè)定。該法對(duì)于冬凌草藥材的質(zhì)量控制具有重要意義。
　　 第四部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中拉西多寧、冬凌草甲素、冬凌草乙素和牛尾草素A及其藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　 目的：建立一種基于多組分同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中拉西多寧、冬凌草甲素、冬凌草乙素和牛尾草素A含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃給予冬凌草提取物后該4種成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究，建立其藥-時(shí)曲線，闡明藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

13、與特征。
　　 方法：大鼠灌胃給與冬凌草提取物(10mL·kg-1)后，分別于給藥后10,30,60,90,105,120,150,180,210,240,300和540min眼內(nèi)眥靜脈叢取血，制備血漿樣品，采用液-液提取方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，磺胺甲惡唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)。色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為0.1％甲酸水-甲醇，梯度洗脫，運(yùn)行時(shí)間為13.50min。采用電噴霧離子源(ESI)，多周期正負(fù)離子同時(shí)掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行定量。

14、4種被測(cè)成分的監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為拉西多寧和冬凌草甲素m/z365.3/347.3，冬凌草乙素m/z361.2/343.2，牛尾草素Am/z363.2/283.1和磺胺甲惡唑m/z254.1/156.0。
　　 結(jié)果：血漿中拉西多寧、冬凌草甲素、冬凌草乙素和牛尾草素A分別在2.24～2240、4.92～4920、5.32～5320和1.36～1360ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.998)，最低定量限(LLOQ)≤1.36

15、ng·mL-1。日內(nèi)、日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于9.1％，相對(duì)誤差（RE）為-8.1％～4.1％。平均提取回收率為70.2％～108.0％。大鼠單次灌胃冬凌草提取物后，血漿中4種成分的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)t1/2α，t1/2β和MRT具有一致性，且4種成分的吸收和消除均較快，但拉西多寧、冬凌草甲素和牛尾草素A的達(dá)峰時(shí)間比冬凌草乙素達(dá)峰時(shí)間長。
　　 結(jié)論：該法靈敏度高、選擇性好、精密度好，可用于大鼠灌胃給與冬凌草提取物后

16、，血漿中拉西多寧、冬凌草甲素、冬凌草乙素和牛尾草素A的藥代動(dòng)力學(xué)研究，該結(jié)果可為冬凌草臨床用藥提供參考。
　　 第五部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定大鼠膽汁中10種二萜類成分及其在膽汁中的排泄研究
　　 目的：建立一種可同時(shí)測(cè)定大鼠膽汁中10種主要二萜（開展香茶菜甲素，拉西多寧，冬凌草甲素，表諾多星，諾多星，冬凌草乙素，牛尾草素A，延命草醇，毛栲利素和貝殼松醇）含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃給予冬凌草提取物后該10種成分的

17、膽汁排泄研究。
　　 方法：健康SD雄性大鼠8只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（2只）和試驗(yàn)組（6只）。試驗(yàn)組大鼠灌胃給予冬凌草提取物（10mL-kg-1），空白對(duì)照組給予等量的水后，行膽管切開術(shù)。分別收集0-1h，1-3h，3-5h，5-8h，8-12h，12-20h和20-24h時(shí)間段的膽汁樣品。采用液-液提取方法進(jìn)行樣品前處理，磺胺甲惡唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)。色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為0.1％甲酸水-甲醇，梯度洗脫，運(yùn)行時(shí)間為15.10min。采

18、用電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行定量。測(cè)定大鼠灌胃給予冬凌草提取物后膽汁中10種二萜的累積排泄率。
　　 結(jié)果：所測(cè)的10種二萜中開展香茶菜甲素，拉西多寧，冬凌草甲素，表諾多星和冬凌草乙素的累積排泄率分別占給藥劑量的10.67，11.23，9.77，20.81和8.55％，而化合物諾多星，牛尾草素A，延命草醇，毛栲利素和貝殼松醇的累積排泄率分別占給藥劑量的20.61，17.22，15.63，8

19、.87和19.42％。
　　 結(jié)論：經(jīng)方法學(xué)考察符合生物樣品的測(cè)定要求，可用于大鼠膽汁中10種二萜濃度的測(cè)定及排泄研究，待測(cè)10種二萜在0～1h內(nèi)，排泄率最高，隨著時(shí)間的推移，排泄率逐漸減少，但在3～5h時(shí)間段時(shí)略有增加，這可能是由于上述成分在腸道不同部位有所吸收入血所致，隨后再逐漸下降所致。
　　 第六部分冬凌草甲素不同血漿中蛋白結(jié)合率測(cè)定
　　 目的：建立冬凌草甲素在大鼠血漿、人血漿和牛血清白蛋白中蛋白結(jié)合率

20、的測(cè)定方法，并計(jì)算不同種屬血漿蛋白的相關(guān)參數(shù)。
　　 方法：采用平衡透析法測(cè)定蛋白結(jié)合率，用高效液相色譜法測(cè)定血漿中藥物總濃度及游離的藥物濃度。
　　 結(jié)果：冬凌草甲素的血漿蛋白結(jié)合率分別為：大鼠血漿：69.66士12.8％、59.62士12.6％、57.94士4.1％；人血漿：78.15士3.6％、77.92士8.8％、76.72士7.3％;牛血清白蛋白：35.58士7.2％、34.59士10.8％、32.03士6.0

21、％。
　　 結(jié)論：本文應(yīng)用平衡透析法研究了冬凌草甲素與人血漿蛋白，牛血清白蛋白和大鼠血漿蛋白的結(jié)合情況，結(jié)果表明冬凌草甲素的血漿蛋白結(jié)合率在60％～70％之間，屬中度血漿蛋白結(jié)合率藥物，大部分藥物分子以游離形式發(fā)揮藥效，并且不具有質(zhì)量濃度依賴性，不易引起具有藥理作用的游離型血藥質(zhì)量濃度發(fā)生明顯變化，說明冬凌草甲素臨床用藥有較好的安全性。
　　 第七部分冬凌草甲素大鼠在體腸吸收動(dòng)力學(xué)研究
　　 目的：建立同時(shí)測(cè)定腸

22、循環(huán)液中冬凌草甲素與酚紅濃度的HPLC/DAD法，探討冬凌草甲素在大鼠各腸段的吸收動(dòng)力學(xué)特征及不同藥物濃度對(duì)其的影響。
　　 方法：采用大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)方法，以HPLC/DAD法測(cè)定腸循環(huán)液中藥物的含量，色譜條件為：DiamonsilC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm);柱溫30℃；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.5％的磷酸(55:15:30)，流速1.0mL·min-1;檢測(cè)波長238nm;進(jìn)樣量20μL。
　　

23、結(jié)果：在5.0～15μg·mL-1內(nèi)冬凌草甲素的吸收量與質(zhì)量濃度成線性關(guān)系，Ka值基本保持不變；冬凌草甲素各腸段的吸收速率無顯著性差異，冬凌草甲素在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的Ka值分別為(0.0475士0.0062)，(0.0468士0.0051)，(0.0346士0，0037),(0.0435±0.0023) h-1
　　 結(jié)論：本文首次建立了HPLC/DAD法同時(shí)測(cè)定腸循環(huán)液中冬凌草甲素及酚紅的濃度，該法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確