DFO、5-ALA聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠大腸癌組織原卟啉Ⅸ聚積的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、大腸癌是常見的惡性腫瘤，加強(qiáng)早期大腸癌的診治，對(duì)提高生存率具有重大意義。激光誘發(fā)熒光技術(shù)為發(fā)現(xiàn)早期大腸癌提供了一種嶄新的診斷方法，具有其它方法難以取代的優(yōu)勢(shì)。δ-氨基-γ-酮戊酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)能誘導(dǎo)腫瘤組織原卟啉Ⅸ積聚，因其本身不具有光敏特性，避免了直接應(yīng)用卟啉光敏劑進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)診斷所產(chǎn)生的光毒副作用，在藥物熒光診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題探討去鐵胺(deferoxamine，DFO)、5

2、-ALA聯(lián)合誘導(dǎo)大腸癌組織原卟啉Ⅸ聚積的特性，對(duì)臨床應(yīng)用DFO、5-ALA聯(lián)合誘導(dǎo)熒光診斷早期大腸癌的可行性進(jìn)行基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)研究。 研究目的： (1)探討DFO、5-ALA聯(lián)合誘導(dǎo)大腸腺癌細(xì)胞原卟啉Ⅸ聚積的動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律及藥物濃度、pH值對(duì)細(xì)胞聚積原卟啉Ⅸ的影響，為該藥物誘導(dǎo)大腸癌組織原卟啉Ⅸ聚積實(shí)驗(yàn)研究提供參考； (2)為DFO、5-ALA聯(lián)合誘導(dǎo)大腸癌組織原卟啉Ⅸ聚積實(shí)驗(yàn)研究建立大腸癌動(dòng)物模型； (3)

3、定量分析5-ALA及DFO、5-ALA聯(lián)合誘導(dǎo)大腸癌大鼠大腸正常組織、早期癌和進(jìn)展期癌組織原卟啉Ⅸ聚積特征，觀察不同組織內(nèi)原卟啉Ⅸ熒光分布及強(qiáng)度的差異； (4)探討5-ALA不同用藥途經(jīng)對(duì)大腸癌大鼠大腸組織原卟啉Ⅸ積聚的影響，為臨床應(yīng)用DFO、5-ALA聯(lián)合誘導(dǎo)熒光診斷大腸早癌提供依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法：采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法以含DFO、5-ALA的培養(yǎng)液孵育大腸腺癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞2小時(shí)，于不同時(shí)間點(diǎn)終止培養(yǎng)，用高效液相色

4、譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)原卟啉Ⅸ的含量，并分別對(duì)DFO、5-ALA聯(lián)合作用不同時(shí)間、不同pH值及不同濃度所誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞原卟啉Ⅸ含量進(jìn)行比較分析。60只SD(sprague-DaWley)大鼠采用二甲肼腹腔注射誘導(dǎo)，纖微膽道鏡動(dòng)態(tài)觀察大鼠大腸內(nèi)變化及成瘤情況。成功誘導(dǎo)含各期大腸癌變的SD大鼠分組分別用生理鹽水、5-ALA及DFO+5-ALA注射，4小時(shí)后解剖大鼠，取出大腸可疑癌變及正常組織標(biāo)本，經(jīng)病理切片確診的大腸正常組織、早癌組

5、織、進(jìn)展期癌組織標(biāo)本分別通過原卟啉Ⅸ提取，用高效液相色譜一熒光檢測(cè)法檢測(cè)其原卟啉Ⅸ含量，并對(duì)DFO、5-ALA聯(lián)合誘導(dǎo)不同時(shí)間3種組織標(biāo)本中原卟啉Ⅸ含量進(jìn)行比較分析，采用激光共聚焦顯微鏡對(duì)3種組織內(nèi)原卟啉Ⅸ熒光分布及強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。在DFO腹腔注射大鼠半小時(shí)后，5-ALA分別采用靜脈注射、口服和保留灌腸3種給藥途經(jīng)誘導(dǎo)，通過對(duì)大腸正常組織、早癌組織及進(jìn)展期癌組織原卟啉Ⅸ進(jìn)行定量分析、熒光分布觀察及強(qiáng)度檢測(cè)，比較3種不同給藥途經(jīng)對(duì)癌變組織原

6、卟啉Ⅸ聚積的誘導(dǎo)效果。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，大腸腺癌細(xì)胞內(nèi)原卟啉Ⅸ含量在藥物作用細(xì)胞40分鐘后明顯升高，在細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)(藥物終止作用后2小時(shí))達(dá)到高峰，之后逐漸下降；在pH值為6.5～7.0、DFO濃度為10～20momL/mL、5-ALA濃度為1.5～2.0momL/mL時(shí)，癌細(xì)胞內(nèi)原卟啉Ⅸ含量最高。SD大鼠大腸癌的發(fā)生主要呈炎癥-萎縮-增生-癌變的發(fā)展過程，大腸癌總誘導(dǎo)率為85％，其中多發(fā)性腫塊占94％。在不同藥物誘

7、導(dǎo)的3組大鼠中，各組大鼠大腸組織原卟啉Ⅸ含量由小到大依次為：大腸正常組織、早期大腸癌、進(jìn)展期大腸癌；3組比較，DFO、5-ALA聯(lián)合誘導(dǎo)組組織原卟啉Ⅸ含量最高，其早癌和進(jìn)展癌組織在用藥4小時(shí)組織原卟啉Ⅸ含量最大、正常組織在用藥2小時(shí)組織原卟啉Ⅸ含量達(dá)到高峰，癌變組織與正常大腸組織原卟啉Ⅸ含量在用藥后4小時(shí)差異最明顯；組織原卟啉Ⅸ紅色熒光在正常組織表達(dá)最弱，早期大腸癌熒光呈點(diǎn)狀散布在癌變組織細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)展期大腸癌病灶局部表現(xiàn)為大量高亮度塊狀

8、熒光；熒光強(qiáng)度分析：正常組織<早期大腸癌<進(jìn)展期大腸。在5-ALA不同的3種給藥途經(jīng)中，靜脈注射癌變組織原卟啉Ⅸ含量最高；保留灌腸給藥取得較好的誘導(dǎo)效果，且癌變組織表層熒光強(qiáng)度大；口服給藥癌變組織原卟啉Ⅸ含量最低。 結(jié)論： (1)DFO、5-ALA聯(lián)合誘導(dǎo)大腸腺癌細(xì)胞原卟啉Ⅸ聚積的最短誘導(dǎo)時(shí)間不得少于40分鐘，最佳檢測(cè)時(shí)間為終止藥作用后2小時(shí)； (2)采用二甲肼腹腔注射、內(nèi)鏡觀察的方法誘導(dǎo)SD大鼠，成功建立了本研