基因敲減亞鐵鰲合酶聯(lián)合小劑量的ALA誘導(dǎo)原卟啉IX積聚診斷早期腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的:
　　內(nèi)窺鏡容易對很多非隆起型癌灶、原位癌、微小腫瘤漏診，因?yàn)槠渫獗砑邦伾c正常組織無異，而分子成像技術(shù)有助早期診斷彌補(bǔ)這一缺陷，腫瘤分子成像是一種反映腫瘤組織的病理生理及代謝變化的顯像。PpIX介導(dǎo)的腫瘤分子成像技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)在于如何特異地增加腫瘤組織中的內(nèi)源性PpIX，以致癌組織與正常組織在PpIX的含量上產(chǎn)生差異。目前國內(nèi)外研究組大多通過應(yīng)用外源性ALA而達(dá)到增加腫瘤組織的PpIX的合成量。然而要在內(nèi)窺鏡下用肉

2、眼直接觀察到腫瘤病灶，必須使用遠(yuǎn)超生理量的大劑量ALA，才能產(chǎn)生足夠的PpIX在腫瘤組織積聚。當(dāng)大劑量的外源性ALA進(jìn)入體內(nèi)后，容易產(chǎn)生全身毒副作用。成為ALA-PpIX分子成像技術(shù)在臨床上應(yīng)用的技術(shù)難關(guān)。腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白通過和受體特異性結(jié)合從而體現(xiàn)出靶點(diǎn)作用，轉(zhuǎn)鐵蛋白納米載體從中作為一個(gè)傳遞載體通過靶向運(yùn)輸siRNA聯(lián)合應(yīng)用小劑量的ALA達(dá)到PpIX在腫瘤積聚，使熒光增強(qiáng)。用siRNA敲減了FECH，阻擋了Pp

3、IX的去路，聯(lián)用了小劑量的ALA增加了PpIX的來源，使得大量PpIX在腫瘤組織內(nèi)積聚，用肉眼即可辨別出腫瘤部位。本實(shí)驗(yàn)通過裸鼠移植瘤為模型，開展活體動(dòng)物體表腫瘤熒光成像從而達(dá)到檢測早期腫瘤的目的。
　　方法:
　　1、篩選TfR高表達(dá)細(xì)胞株。選取三株婦科腫瘤細(xì)胞，用熒光定量PCR和WesternBlot法分別于不同時(shí)間點(diǎn)(12h，24，36)，給予不同濃度的Deferoxamine(0.05mM、0.1mM、0.15mM)

4、檢測腫瘤細(xì)胞基因水平和蛋白水平TfR的表達(dá)情況。
　　2、用TransMessenger kit(Qiagen)轉(zhuǎn)染高表達(dá)TfR細(xì)胞株以沉默F(xiàn)ECH在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。檢測TfR高表達(dá)細(xì)胞株內(nèi)的PpIX熒光。用高表達(dá)TfR細(xì)胞株進(jìn)行以下分組實(shí)驗(yàn):Control組，ALA組(0.025mM、0.05mM、0.1mM)，mix-siRNA-FECH組(0.16uM),mix-siRNA-FECH組(0.16uM)+ALA(0.025mM)

5、組，mix-siRNA-FECH組(0.16uM)+ALA(0.05mM),mix-siRNA-FECH組(0.16uM)+ALA(0.1mM)檢測各組細(xì)胞內(nèi)的PpIX熒光。
　　3、優(yōu)選ALA的最小劑量:接種高表達(dá)TfR細(xì)胞株，建立裸鼠腹膜移植瘤模型，待成模后，采取裸鼠瘤內(nèi)注射的方法，給予不同濃度的ALA(1mg/kg，2.5mg/kg，5mg/kg)，小動(dòng)物活體成像儀檢測裸鼠腫瘤組織內(nèi)PpIX熒光。
　　4、檢測動(dòng)物模型

6、腫瘤組織內(nèi)的PpIX熒光。檢測動(dòng)物模型腫瘤組織內(nèi)的PpIX熒光。對成模的裸鼠，分別進(jìn)行以下分組:Tf-Liposome組，invivofection組，ALA組，si-FECH組，TfR-liposome-ALA+siRNA-FECH組，TfR-liposome-ALA+invivofection-siRNA-FECH組檢測各組動(dòng)物腫瘤組織內(nèi)熒光。
　　結(jié)果：
　　1、Hela229、mcf-7、skov3三株不同的細(xì)胞株，

7、分別于不同時(shí)間點(diǎn)(12h、24h、36h)給予不同濃度的DFO，篩選出了一個(gè)高表達(dá)TFR細(xì)胞株:SKOV3。
　　2、檢測TfR高表達(dá)細(xì)胞株內(nèi)的PpIX熒光顯示:Control組沒有熒光，ALA組和siRNA-FECH組有微弱的熒光，但熒光強(qiáng)弱沒有太大差異，ALA+siRNA-FECH組熒光最強(qiáng)。
　　3、動(dòng)物腫瘤模型:局部注射能出現(xiàn)PpIX熒光所用的最小ALA劑量是5mg/kg。
　　4、裸鼠腫瘤模型中檢測PpIX熒

8、光:Tf-Liposome組，invivofection組，ALA組，沒有熒光。si-FECH組，TfR-liposome-ALA+siRNA-FECH組有輕微熒光或者是背景光，TfR-liposome-ALA+invivofection-siRNA-FECH組Tf-Liposome組具有特異性熒光。
　　結(jié)論：
　　基于PpIX介導(dǎo)的分子腫瘤成像技術(shù)以及應(yīng)用外源性ALA而達(dá)到增加腫瘤組織的PpIX的合成量，我們用siRNA