糖原累積癥-Ⅲ型的臨床和糖原脫枝酶基因突變分析.pdf

1、糖原累積癥-Ⅲ型的臨床和糖原脫枝酶基因突變分析背景目的：糖原累積癥是以糖原代謝障礙為特點的一組呈高度遺傳異質(zhì)性的遺傳代謝病；病因是催化糖原合成和分解的某些酶先天性缺陷。臨床上根據(jù)不同糖原累積癥發(fā)現(xiàn)的時間順序和酶蛋白缺陷的不同，用羅馬數(shù)字把它分為10個亞型，即糖原累積癥-Ⅰ型(Glycogenstoragedisease-typeⅠ，GSD-Ⅰ型)、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅵ型、Ⅸ型、0型、Fanconi-Bickel綜合征、GSD-Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅶ型

2、。 GSD-Ⅲ型(MIM232400)是由于糖原脫枝酶(amyloglucosidase，AGL)活性缺乏引起的一組臨床癥狀。AGL活性缺乏使糖原在糖鏈分枝處分解葡萄糖時出現(xiàn)障礙，導致大量形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的短側(cè)鏈糖原在肝臟伴或不伴在肌肉蓄積；出現(xiàn)肝腫大、低血糖和酸中毒等臨床癥狀和病理生化改變；本病為常染色體隱性遺傳病。 在兒童期最常見的是GSD-Ⅰ型和GSD-Ⅲ型，二者臨床表型相似，但治療和預(yù)后卻不同；GSD-Ⅲ型胎兒的羊水

3、絨毛細胞中AGL活性相對較低，用酶學測定存在技術(shù)上困難。如何從臨床和分子生物學水平進行研究是臨床診斷、治療和產(chǎn)前診斷等面臨的問題。 AGL定位于1p21，DNA全長85kb，包含35個外顯子，AGL單體蛋白包含1532個氨基酸，分子量為170kDa。目前在非洲、亞洲及歐美等國家已經(jīng)有GSD-Ⅲ型的報道，一般采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP)，DNA序列分析

4、，限制性酶學分析和家系分析等方法對AGL基因進行分子生物學研究，發(fā)現(xiàn)了多達51種不同的突變，但至今仍未發(fā)現(xiàn)突變熱點。鑒于中國對糖原累積癥的研究起步較晚，國內(nèi)尚未見到GSD-Ⅲ型的相關(guān)研究。本論文擬對近二十年來在北京協(xié)和醫(yī)院兒科遺傳咨詢門診就診，臨床診斷為GSD-Ⅲ型的22例患兒的臨床特點進行分析，并對其中的6個家系進行AGL基因突變分析(即DNA序列分析)和家系分析；以期了解中國GSD-Ⅲ型的臨床表現(xiàn)和AGL基因突變情況，為在國內(nèi)建立G

5、SD-Ⅲ型的診斷體系打下初步基礎(chǔ)。 方法：收集1980年至2004年間在北京協(xié)和醫(yī)院兒科遺傳咨詢門診就診，并住院治療，長期隨診的臨床診斷為GSD-Ⅲ型的22例患兒(均符合以下入選標準)進行臨床分析；在知情同意的基礎(chǔ)上，對其中6例GSD-Ⅲ型患兒及其家系成員(共18人)進行AGL基因突變分析，即應(yīng)用GSD-Ⅲ型患兒及其父母的外周血DNA，采用PCR的方法，對GSD-Ⅲ型患兒的AGL基因中參與編碼蛋白的33個外顯子和相鄰的內(nèi)含子進行

6、擴增和直接測序，之后進行AGL基因突變分析。 GSD-Ⅲ型臨床入選標準：具備(1)臨床表現(xiàn)：自幼發(fā)現(xiàn)肝腫大；自幼出現(xiàn)復(fù)發(fā)性低血糖。(2)空腹腎上腺素刺激1小時后血糖上升＜35mg/dl；餐后2小時腎上腺素刺激1小時后血糖上升≥35mg/dl。(3)除外其他因素引起的肝腫大。 結(jié)果：1、臨床部分：臨床診斷為GSD-Ⅲ型的22例患兒分布于全國15個省市，男16例，女6例；平均出現(xiàn)癥狀年齡為1.2±0.9歲，平均就診年齡為5.

7、1±4.1歲。22例GSD-Ⅲ型患兒均有低血糖表現(xiàn)，即易饑餓癥狀(約40.9％)，低血糖抽搐(約27.3％)，無癥狀性低血糖(約22.7％)，鼻衄(約4.5％)，低血糖暈厥(約4.5％)；均有肝臟明顯增大(觸診平均肋下10.0cm左右)，Bus超聲未發(fā)現(xiàn)纖維化樣改變；22例GSD-Ⅲ型患兒的空腹腎上腺素刺激試驗1小時后血糖上升均＜35mg/dl(血糖值平均升高18.7±11.2mg/dl)；餐后2小時腎上腺素刺激試驗1小時后血糖上升均≥

8、35mg/dl(血糖值平均升高75.5±33.9mg/dl)；均除外了其他因素引起的肝臟腫大，符合GSD-Ⅲ型的臨床入選標準。 另外，22例GSD-Ⅲ型出現(xiàn)脾臟增大(約90.0％，B超下脾厚大約3.4cm左右)；身材矮小(約72.7％)，骨齡落后(約37.5％)和體重偏低(約27.3％)；肌無力癥狀(約50％)和心臟肥大(約31.3％)。腎臟不增大(100％)。 22例GSD-Ⅲ型患兒的谷丙轉(zhuǎn)氨酶均升高(100％，平均值

9、為420.6±585.5u/l)；酸中毒(約68.2％，剩余堿平均值為-5.5±4.3mmol/l)；空腹血糖低于正常(約68.2％，血糖平均值為43.2±15.6mg/dl)，空腹血糖偏低值(約占31.8％，血糖平均值為58.5±10.25mg/dl)；高血脂(約59.1％，甘油三酯平均值為287.1±257.5mg/dl，膽固醇平均值為226.9±118.3mg/dl)；肌酸激酶等心肌酶升高(約70.6％，肌酸激酶平均值為730.5

10、±870.7u/l，乳酸脫氫酶平均值為414.1±151.9u/l，谷草轉(zhuǎn)氨酶平均值為534.1±512.8u/l，α-羥丁酸脫氫酶平均值為363.8±105.1u/l)；4例(20例)GSD-Ⅲ型患兒的尿酸輕度升高(約20％)。 10例(19例)血乳酸輕微升高(約52.6％)。22例GSD-Ⅲ型患兒中6例患兒的組織病理提示肝臟內(nèi)有大量糖原累積(100％)。 2、基因部分：在患兒2的AGL基因檢測中發(fā)現(xiàn)外顯子8同義突變(

11、894C→T，L298L，父源)和外顯子34無義突變(4348G→T,E1450X，母源)。在患兒3中發(fā)現(xiàn)外顯子3上游非翻譯區(qū)-10G→A堿基替換(母源)和外顯子8同義突變(894C→T，L298L,父源)。在患兒4中發(fā)現(xiàn)外顯子35下游+65位非翻譯區(qū)4664insCT。在患兒5中發(fā)現(xiàn)外顯子10錯義突變(1160G→A，R387Q，母源)和外顯子16移碼突變(1944_1951delGCCATAGA，648X，父源)。在患兒6中發(fā)現(xiàn)外顯

12、子12無義突變(1287T→G，Y429X，母源)和外顯子26錯義突變(3343G→A，G¨15R，父源)。在患兒1的外顯子和相鄰內(nèi)含子區(qū)中未發(fā)現(xiàn)突變。 結(jié)論：1、GSD-Ⅲ型臨床特征：1)GSD-Ⅲ型的AGL基因突變導致AGL酶的質(zhì)和/或量發(fā)生改變，引起臨床一系列表現(xiàn)，即全部GSD-Ⅲ型患兒表現(xiàn)低血糖癥狀、肝腫大和腎臟不大，絕大多數(shù)伴脾腫大，部分患兒表現(xiàn)為身材矮小和肌無力等癥狀，全部患兒谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高，部分患兒有低血糖、酸中毒

13、、高血脂和肌酸激酶升高等生化指標改變，部分患兒出現(xiàn)骨齡落后、心臟肥大和體重偏低；GSD-Ⅲ型患者需密切隨訪肝臟功能及其病理改變。 2)GSD-Ⅲ型患兒空腹腎上腺素刺激實驗血糖不能正常升高，餐后腎上腺素刺激實驗血糖正常升高。 2、AGL基因突變分析部分：1)在6例GSD-Ⅲ型患兒的AGL基因中發(fā)現(xiàn)三種新突變，即外顯子12的1287T→G(Y429X)、外顯子16的1944_1951delGCCATAGA(648X)和外顯子

14、34的4348G→T(E1450X)，支持臨床GSD-Ⅲ型的診斷；檢測出五種多態(tài)性改變，即外顯子3的-10G→A、外顯子8的894C→T(L298L)、外顯子10的1160G→A(R387Q)、外顯子26的3343G→A(G1115R)和外顯子35的+65位4664insCT。其中G1115R、E1450X和4664insCT位于AGL糖原結(jié)合區(qū)；R387Q、Y429X和648X位于AGL酶的活性區(qū)域。 2)本研究發(fā)現(xiàn)的三種新突