多發(fā)性骨髓瘤血漿miRNA分子標(biāo)志物研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(MM)是骨髓漿細(xì)胞惡性腫瘤?；颊吖撬柚锌寺⌒詽{細(xì)胞異常增生，并分泌單克隆免疫球蛋白或其片段，導(dǎo)致相關(guān)器官或組織損傷。常見臨床表現(xiàn)為骨痛、貧血、腎功能不全和免疫力低下等。
　　 幾乎所有的MM患者都具有多個復(fù)雜的基因異常。基因異?？煽偟姆譃槌扼w和非超二倍體亞型。近半數(shù)的骨髓瘤的病例是非超二倍，其中大多具有IgH轉(zhuǎn)位；而超二倍體亞型骨髓瘤細(xì)胞具有三體性染色體導(dǎo)致染色體數(shù)目為奇數(shù)。許多研究發(fā)現(xiàn)的基因異常與疾病進(jìn)展和生

2、存期相關(guān)，如RAS的突變、MYC失調(diào)、13號染色體和17號染色體的缺失、1號染色體異常以及NF-κB激活等。盡管在多發(fā)性骨髓瘤的分子遺傳學(xué)方面的研究取得進(jìn)展，但該疾病的始發(fā)與進(jìn)展機制仍然有待闡明。
　　 有研究發(fā)現(xiàn)屬于mRNA范疇的microRNA(miRNA)不儀在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化上可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且與腫瘤的發(fā)生也密切相關(guān)。到目前為止，在人類的基因組中發(fā)現(xiàn)的miRNA分子超過1000個。每個miRNA分子都有數(shù)百個不同的

3、保守或非保守靶基因，據(jù)估計有50％的基因受miRNA調(diào)控。幾乎全部已發(fā)現(xiàn)的miRNA分子在相鄰物種中呈高度保守，暗示了其功能上的保守性。miRNA已被證明在不同基因表達(dá)調(diào)控途徑，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂、分化、造血作用及癌癥發(fā)生等方面都具有重要的作用。很多實驗證實miRNA在腫瘤組織中表達(dá)水平發(fā)生變化，具有致癌基因或抑癌基因的作用。對miRNA在不同組織和疾病中的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達(dá)譜具有明顯的組織特異性，在一些疾病

4、中miRNA的表達(dá)譜改變具有明顯的特征，尤其是在腫瘤疾病中，與正常組織相比腫瘤組織中miRNA表達(dá)明顯改變。此外，miRNA在不同腫瘤中具有特定的表達(dá)模式，miRNA在腫瘤中表達(dá)的這些特點在肝癌、肺癌、腸癌、卵巢癌和白血病等多種惡性腫瘤中得到了證實。這些特點也使miRNA有可能成為腫瘤診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記和治療藥物作用的靶標(biāo)。
　　 miRNA從腫瘤細(xì)胞中釋放到體液中，可作為一系列癌癥的診斷標(biāo)記物。最近有研究報道m(xù)iRNA分子可

5、從乳腺癌細(xì)胞中釋放到血液，乳汁和乳腺導(dǎo)管液中，這些體液中的miRNA分子可以作為癌癥分子標(biāo)記物的備選分子。為確認(rèn)循環(huán)miRNA是否為腫瘤特異性的，有研究分析了多種癌癥(黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和腎癌)術(shù)前患者的全血中的一系列的癌癥相關(guān)miRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-195在乳腺癌患者中特異性增高，有別于其他癌癥患者和健康人群。此外，在乳腺癌術(shù)后的患者循環(huán)miR-195和let-7a水平與健康對照人群相比顯著下降。這些發(fā)現(xiàn)提示循

6、環(huán)miRNA具有成為乳腺癌早期診斷的生物標(biāo)記的潛能。循環(huán)miRNA可作為疾病診斷與預(yù)后判斷的牛物標(biāo)記物，尤其對癌癥的早期診斷與治療策略的選擇有重要意義。
　　 近年來miRNA參與MM發(fā)病機理的研究較多。通過miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，在MM患者的骨髓瘤細(xì)胞中miRNA-29b的表達(dá)水平顯著下降，在人類骨髓瘤細(xì)胞株(HMCLs)中也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。在HMCLs中過表達(dá)miR-29b，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和caspase-3活性增高。進(jìn)一步研

7、究發(fā)現(xiàn)miRNA-29b的靶基因為Mcl-1(myeloid-cell-leukemia1)，通過抑制Mcl-1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、提高caspase活性并拮抗IL-6在HMCLs中的促瘤作用。這一研究結(jié)果提示miR-29b在MM中充當(dāng)重要的癌癥抑制因子。MiR-106b～25群、miR-181a/b和miR-19a/b在MM骨髓漿細(xì)胞中與健康對照人群相比表達(dá)升高。此外miR-106b-25群、miR-32、miR-181a/b和miR-19

8、a/b下調(diào)SOCS1(為IL-6的抑制因子)和p300-CBP(為p53通路組分)，抑制上述miRNA分子表達(dá)可抑制多發(fā)性骨髓瘤動物模型中骨髓瘤瘤體的生長。MiR-25和miR-30d可與TP53基因的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，并可降低p53蛋白水平、降低p53通路下游的基因表達(dá)。此外，miR-25和miR-30d可影響細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯。在多個多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株中抑制這兩個分子的表達(dá)，可提高內(nèi)生性p53的表達(dá)及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。這個研究提示

9、在骨髓瘤細(xì)胞株中的miR-25和miR-30d可負(fù)性調(diào)控重要的抑癌基因TP53。
　　 基于以上研究現(xiàn)狀，我們提出了一些疑問：多發(fā)性骨髓瘤患者外周循環(huán)中的miRNA表達(dá)是否有其特異性的改變?異常表達(dá)的miRNA對與疾病的診斷、預(yù)后有無關(guān)聯(lián)呢?為了解決這些疑問，我們進(jìn)行了以下三部分研究：1)測定多發(fā)性骨髓瘤患者血漿中miRNA表達(dá)譜；2)探討miRNA與患者預(yù)后和臨床特征有無關(guān)聯(lián)。3)篩選出的miRNA分子是否參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)

10、生發(fā)展。
　　 第一部分，多發(fā)性骨髓瘤血漿miRNA表達(dá)譜的研究
　　 miRNA是一類重要的非編碼RNA，參與調(diào)控真核生物細(xì)胞許多種生物學(xué)過程。有關(guān)miNA在疾病中的研究，尤其是miRNA的異常表達(dá)與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，引起研究者的廣泛關(guān)注。
　　 本部分實驗主要目的是研究多發(fā)性骨髓瘤患者血漿miRNA表達(dá)譜，篩選出異常表達(dá)的miRNA。應(yīng)用特異度較高的TaqManmicroRNA芯片分析多發(fā)性骨髓瘤患者血漿m

11、iRNA的表達(dá)；應(yīng)用軟件分析分析多發(fā)性骨髓瘤與正常對照之間的差別；用real-timePCR分析進(jìn)一步檢測某些特定miRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果顯示，8個正常人和12個多發(fā)性骨髓瘤患者血漿miRNA表達(dá)譜并用SAM算法進(jìn)行分析，多發(fā)性骨髓瘤患者血漿miRNA的表達(dá)與正常對照有明顯的差別，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，患者與健康對照的血漿中共檢測到135個miRNA分子，其中有6個miRNA在多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中表達(dá)差異顯著，這六個miRNA

12、(miR-148a、miR-20a、miR-99b、miR-221、miR-181a和miR-625)均表達(dá)上調(diào)。
　　 第二部分，多發(fā)性骨髓瘤血漿miRNA表達(dá)水平與基因亞型和染色體組型的關(guān)聯(lián)
　　 多發(fā)性骨髓瘤是具有高度異質(zhì)性的疾病，其患者病程為診斷后數(shù)周到十年以上不等。有證據(jù)表明其高度異質(zhì)性與腫瘤細(xì)胞的基因亞型相關(guān)。然而該疾病的預(yù)后判斷缺乏簡便可靠的指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)血清miRNA有望成為新興的腫瘤診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志

13、物。
　　 本課題擴(kuò)大研究對象，用real-timePCR方法進(jìn)一步驗證某些特定miRNA的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)除miR-625之外，其余5個miRNA(miR-148a、miR-20a、miR-99b、miR-221和miR-181a)在多發(fā)性骨髓瘤患者中高水平表達(dá)。并結(jié)合患者的臨床特征與預(yù)后，分析與染色體組型、預(yù)后相關(guān)的miRNA。目前已發(fā)現(xiàn)miR-148a和miR-20a與患者預(yù)后相關(guān)，miR-99b、miR-221分別與染色體組型

14、t(4；14)和del(13q)相關(guān)。
　　 第三部分，miR-148a在多發(fā)性骨髓瘤中起癌基因作用
　　 有研究表明多個miRNA分子參與MM的發(fā)生發(fā)展，在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)miR-148a在患者的血漿中升高，并且該分子的高水平與患者較差的預(yù)后相關(guān)。此外有文獻(xiàn)報道該分子在患者骨髓中的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)也升高，然而該分子參與MM發(fā)病的機理仍有待研究。
　　 通過轉(zhuǎn)染miR-148ainhibitor，研究miR-1

15、48a對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-148ainhibitor后，細(xì)胞的增殖能力下降而凋亡細(xì)胞的比率增高。
　　 我們用Targetscan等軟件分析發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤患者血漿中表達(dá)水平升高的miR-148a的靶基因為CDKN1B(P27)和PTEN等抑癌基因。通過熒光素酶報告基因檢測證實了miR-148a可與靶基因的3’UTR結(jié)合。應(yīng)用westernblot證實miR-148a可抑制靶基因的表達(dá)。