肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)移植顆粒脂肪存活率的影響.pdf

1、目的：1.了解大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及歸巢特征；2.通過(guò)重組腺病毒介導(dǎo)的人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，探討其轉(zhuǎn)染效率、目的基因的表達(dá)情況；3.探討攜帶有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)移植顆粒脂肪的新生血管和存活率的影響。 方法：1.采用密度梯度離心法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖周期，傳代后的細(xì)胞成脂誘導(dǎo)。用Ad-GFP轉(zhuǎn)染第3代MSCs，25只Wistar大鼠隨機(jī)分為延遲復(fù)

2、蘇組(A組，10只)、即時(shí)復(fù)蘇組(B組，10只)、假燙組(C組，5只)：A、B兩組大鼠背部造成Ⅲ度30％燙傷，制備A組為延遲復(fù)蘇模型，B組為即時(shí)復(fù)蘇模型，同時(shí)制備C組為假燙模型，經(jīng)股靜脈移植轉(zhuǎn)染Ad-GFP48h后的MSCs；24h，7d后取小腸、肝臟、腎臟、燙傷皮膚創(chuàng)緣等組織，快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察在體內(nèi)的分布。2.取第3代大鼠MSCs，以不同感染強(qiáng)度(MOI)(50，100，150，200)的Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs，轉(zhuǎn)染后

3、的48小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，篩選最佳感染強(qiáng)度。Ad-HGF以最佳感染強(qiáng)度轉(zhuǎn)染MSCs，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中HGF的表達(dá)。3.Wistar雌性大鼠150只，隨機(jī)分為五組：A組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG；B組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1 × 108pfuAd-HGF液：C組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1 × 106MSCs；D組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1× 106M

4、SCs(攜帶GFP基因)；E組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1 × 106MSCs(攜帶HGF基因)均勻震動(dòng)5分鐘，移植于背部皮膚與肌肉之間。移植后3d、5d、7d、14d、28d、60d每組各取5只脫頸處死，沿被膜分離出移植物，測(cè)體積，并行HE、maaaon’s染色觀察病理改變，免疫組化法測(cè)定組織的HGF、CD34表達(dá)水平。 結(jié)果：1.MSCs體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增5代，細(xì)胞數(shù)可達(dá)(1～2)×1011個(gè)，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞

5、樣外觀和貼壁生長(zhǎng)特性，細(xì)胞周期分析表明：G0/G1期細(xì)胞占79.3％，S+G2+M期細(xì)胞為21.7％，分離的細(xì)胞可以在誘導(dǎo)體系下向脂肪細(xì)胞分化；經(jīng)股靜脈移植攜帶GFP基因的MSCs，24h后觀察，在延遲復(fù)蘇組燙傷皮膚組織創(chuàng)緣，小腸黏膜廣泛可見綠色熒光，而肝、肺等器官少見，即時(shí)復(fù)蘇組熒光以燙傷皮膚創(chuàng)緣分布為主，小腸黏膜較少，假燙組中綠色熒光分布以肝臟為主。延遲復(fù)蘇組小腸熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于即時(shí)復(fù)蘇組和假燙組(P<0.05)，而延遲和即時(shí)復(fù)蘇組

6、皮膚創(chuàng)緣熒光強(qiáng)度又強(qiáng)于假燙組(P<0.05)。2.在Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs48小時(shí)，GFP的表達(dá)明顯增強(qiáng)，熒光顯微鏡觀察可見明顯的綠色熒光，分別用不同的效價(jià)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小時(shí)后流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染率，結(jié)果顯示，病毒強(qiáng)度MOI=100時(shí)轉(zhuǎn)染率最高達(dá)86.4％；轉(zhuǎn)染HGF后MSCs對(duì)HGF表達(dá)48h達(dá)到高峰，以后隨時(shí)間開始降低。3.Ad-HGF轉(zhuǎn)染MSCs組的移植體中HGF表達(dá)3d呈強(qiáng)陽(yáng)性，隨移植時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減弱，并且3d、5d、7d、14

7、d表達(dá)明顯強(qiáng)于其他組(P<0.05)，而28d、60d時(shí)與其他組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ad-HGF轉(zhuǎn)染MSCs組新生血管7d左右達(dá)高峰，14d后趨于平穩(wěn)，在5d、7d、14d、28d、60d血管數(shù)量多于其他組(P<0.05)。28d和60d時(shí)，Ad-HGF感染MSC組顆粒脂肪體積保持率明顯好于其他四組(P<0.05)。結(jié)論：1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外能向成脂分化；導(dǎo)入目的基因不會(huì)改變MSCs歸巢特性；2.重組腺病毒可介導(dǎo)肝細(xì)