斑馬魚TBK1L功能研究與草魚p47phox-p40phox基因克隆.pdf

1、TANK結(jié)合激酶1(TBK1)是一種對TRL和RIG-Ⅰ介導(dǎo)的MAVS依賴的抗病毒免疫相關(guān)信號通路中發(fā)揮作用的關(guān)鍵激酶，并且是誘導(dǎo)Ⅰ型IFN產(chǎn)生和宿主抗病毒反應(yīng)必備的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。本文研究的TBK1樣轉(zhuǎn)錄子即TBK1L是從斑馬魚克隆而來。相對比TBK1而言，TBK1L含有一個不完全的S TKc結(jié)構(gòu)域，缺少UBL_TBK1結(jié)構(gòu)域。實時定量PCR結(jié)果顯示:TBK1L在胚胎、初孵的魚卵及ZF4細胞中持續(xù)表達，當(dāng)用ssRNA病毒鯉春病

2、毒血癥病毒(SVCV)刺激ZF4細胞，TBK1L表達量并沒有改變。在斑馬魚胚胎或ZF4細胞中TBK1的過表達能顯著誘導(dǎo)斑馬魚IFN1和IFN3啟動子的激活，而TBK1L的過表達卻不能導(dǎo)致斑馬魚IFN1和IFN3啟動子的激活。同樣，在CPE細胞中轉(zhuǎn)染TBK1具有抗SVCV效果，TBK1L卻無抗病毒作用。然而過表達的TBK1L卻能在RLRs、MAVS和TBK1的介導(dǎo)下抑制斑馬魚IFN1或IFN3啟動子激活。此外，斑馬魚胚胎細胞中過表達TBK

3、1能夠誘導(dǎo)IFN激活基因（ISGs）的上調(diào)表達，而在胚胎中過表達TBK1L卻使許多的ISGs表達量下降。這些研究結(jié)果表明斑馬魚TBK1L負調(diào)控RLRs-MAVS-TBK1信號通路。
　　吞噬細胞NADPH氧化酶能生成用于清除病原微生物的活性氧(ROS)，在機體的防御體系中起著非常重要的作用。目前有關(guān)魚類NADPH氧化酶功能報道較少，特別是魚類p47phox、p40phox表達模式鮮有報道。
　　本實驗運用了RT-PCR結(jié)合R

4、ACE-PCR方法克隆了草魚NADPH氧化酶的兩個調(diào)節(jié)亞基p47phox和p40phox的cDNA全長，分別擴增其ORF，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒Flag-p47phox/Flag-p40phox，運用實時熒光定量PCR方法分析了健康草魚p47phox/p40phox基因的組織表達模式。為研究草魚p47phox和p40phox抗菌免疫功能奠定基礎(chǔ)。草魚p47phox/p40phox基因cDNA全長分別為1589bp/2103bp。開放閱讀框(O

5、RF)分別為1233bp/1068bp，分別編碼410/355個氨基酸(aa)，與其它硬骨魚類的相似性分別為68-91％和81-96％。氨基酸序列分析顯示:草魚p47phox含有1個PX結(jié)構(gòu)域，2個SH3結(jié)構(gòu)域，1個PC基序。草魚p40phox含有一個PX結(jié)構(gòu)域，一個SH3結(jié)構(gòu)域，一個PB1結(jié)構(gòu)域。實時熒光定量PCR的結(jié)果顯示:p47phox和p40phox在草魚胸腺、心、頭腎、鰓、腸、肝、腎、脾、皮膚各組織中均有表達，其中在皮膚，心臟