8-OHdG和NADPH氧化酶p47phox G338A基因多態(tài)性與2型糖尿病腎臟病的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:糖尿病腎臟病(Diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥。DKD的發(fā)病機制與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、易感基因及腎血流動力學(xué)改變等多方面因素有關(guān)。Brown Lee[1]提出糖尿病及其并發(fā)癥的統(tǒng)一機制學(xué)說，其核心是高糖引發(fā)的氧化應(yīng)激(Oxidative stress，OS)。NADPH氧化酶是催化氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)生成的關(guān)鍵酶，廣泛存在于腎血管內(nèi)皮

2、細胞、腎小球系膜細胞和足細胞，分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，NADPH氧化酶亞基p47phox第338位上存在G→A突變，這與ROS產(chǎn)生增加及DKD發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。8-羥基脫氧鳥苷(8-Hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)是DNA氧化損傷的特異指標(biāo)，因其影響因素少，在體內(nèi)含量穩(wěn)定，被公認(rèn)為評價機體氧化損傷程度的理想標(biāo)志物[3]。本研究的目的是①通過酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosor

3、bent assay，ELISA)檢測2型糖尿病(Type2diabetes mellitus，T2DM)患者血清中8-OHdG含量，從而明確氧化應(yīng)激在糖尿病及其腎臟疾病發(fā)生中所起的作用;②通過聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)聯(lián)合單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide polymorphism，SNP)直接測序法探討河北地區(qū)漢族人群NADPH氧化酶p47phox基因G338A多態(tài)性與D

4、KD的發(fā)病及其病情程度關(guān)系，旨在對DKD的診斷及防治提供分子遺傳學(xué)的理論依據(jù)。
　　方法:依據(jù)1999年WHO糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，選取本院內(nèi)分泌科住院的T2DM患者198例，根據(jù)尿白蛋白與肌酐比值(尿A/Cr)將患者分為三組，A:單純T2DM(Simple diabetes，SDM)組70例，其中男43例，女27例，年齡56.20±7.74歲，病程6.02±2.08年;B:微量白蛋白尿組65例，其中男41例，女24例，年齡58.

5、09±9.42歲，病程9.73±4.59年;C:大量白蛋白尿組63例，其中男39例，女24例，年齡57.89±11.17歲，病程10.47±5.21年。正常對照(Normal control，NC)組為同期我院醫(yī)務(wù)人員及常規(guī)體檢者中健康個體70例，其中男42例，女28例，年齡94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，完成30次循環(huán)，末次循環(huán)后，在72℃充分延伸3 min，4℃冷卻10 min。③進行PCR反應(yīng)產(chǎn)物的純化

6、，PCR產(chǎn)物純化試劑盒由上海捷瑞生物工程有限公司提供。④純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)SNP測序儀進行測序，測序結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫中進行比較分析，證實P47phox基因第4外顯子G338A多態(tài)性有GG、GA、AA三種基因型。
　　(6)統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理，對各組多態(tài)位點基因分布進行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢測;計量資料進行正態(tài)性檢驗，統(tǒng)計描述以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示;組

7、間比較用方差分析;基因型頻率和等位基因頻率的比較用卡方檢驗;8-OHdG濃度與其他因素的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析法;用多元逐步回歸法分析各因素在T2DM腎臟病變發(fā)生中各自獨立的作用及相對影響大小。
　　結(jié)果:①正常對照組與T2DM組的年齡、性別構(gòu)成比無差異(P＞0.05)，具有可比性;與正常對照組比較，T2DM組的BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG及LDL-C均明顯升高，HDL-C明顯降低(P＜0.05或P＜0.

8、01);與單純T2DM組相比，DKD兩組的病程、SBP、DBP、TC及TG均顯著升高，HDL-C明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);與微量白蛋白尿組相比，大量白蛋白尿組病程、SBP、DBP明顯升高，LDL-C則明顯降低(P＜0.05)，HDL-C則無明顯差異（見Fig.1，Table1）。②單純T2DM組血清8-OHdG水平(5.02±0.69)較正常對照組（3.03±0.64）明顯升高(P＜0.05); DKD兩組血清8-OHdG

9、水平均明顯高于正常對照組和單純T2DM組(P＜0.01)，且大量白蛋白尿組(9.33±1.71)較微量白蛋白尿組(7.44±0.97)顯著升高(P＜0.05)（見Fig.2）。③血清8-OHdG與病程(r=0.264,P=0.001)、 SBP(r=0.195,P=0.004)、FBG(r=0.217,P=0.000)、HbA1c(r=0.198,P=0.005)、TC(r=0.173,P=0.008)、TG(r=0.296, P=0.

10、000)和LDL-C(r=0.187，P=0.007)呈顯著正相關(guān)，與HDL-C呈顯著負相關(guān)(r=-0.271，P=0.000)（見Table2）。④正常對照組、單純T2DM組、微量白蛋白尿組及大量白蛋白尿組GA+AA基因型頻率分別為11.4％、18.6％、32.3％和38.1％，A等位基因頻率分別為5.7％、10.0％、17.7％和21.4％。比較各組間的GA+AA基因型和A等位基因頻率，單純T2DM組與正常對照組間無顯著性差異;DK

11、D兩組該頻率均明顯高于正常對照組和單純T2DM組;而DKD兩組間該頻率無顯著性差異（見Fig.6，Table3）。⑤不同基因型組間年齡、性別、DBP、TC、TG、LDL-C、HDL-C均無顯著性差異(P＞0.05);與GG型相比，GA+AA型的病程、HbA1c、FBG、SBP及8-OHdG均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。GA+AA基因型組中DKD發(fā)病率為68.2％，顯著高于GG基因型組的41.1％（X2為14.635，P＜0.

12、01）;GA+AA基因型與GG基因型相比，DKD發(fā)生率的危險度OR=3.072，OR值的95％可信區(qū)間為(1.705，5.537)，即GA+AA基因型患DKD的風(fēng)險約是GG基因型的3倍（見Fig.7、8，Table4、5）。⑥多元逐步回歸分析顯示:病程(β=0.257，P=0.036)、LDL-C(β=0.357，P=0.015)、SBP(β=0.291，P=0.019)、FBG(β=0.285,P=0.022)和8-OHdG(β=0.