中分子量神經(jīng)絲亞單位單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、目的:制備抗神經(jīng)絲中分子量亞單位(NF-M)的單克隆抗體(McAb)，為神經(jīng)絲檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:將人、大鼠、小鼠NF-M氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，選擇合適的氨基酸序列GNPSAYRRVTETRSSFSRVSGSPSSGFRSQSWSRGSP-C進(jìn)行多肽合成，合成后的多肽通過(guò)Sulfo-SMCC與匙孔槭血藍(lán)蛋白(KLH)載體蛋白偶聯(lián)。將偶聯(lián)后的多肽KLH-NF-M作為抗原，以腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠。首次免

2、疫使用福氏完全佐劑乳化抗原，其后的免疫使用福氏不完全佐劑乳化，每隔2周免疫一次。多次免疫后，小鼠內(nèi)眥取血，離心取血清。以NF-M多肽包被酶標(biāo)板，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定小鼠外周血中抗體效價(jià)。選擇血清抗體效價(jià)高的小鼠，進(jìn)行脾內(nèi)免疫，3天后處死小鼠，取其脾細(xì)胞。采用細(xì)胞融合技術(shù)，PEG4000為融合劑，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞（sp2/0細(xì)胞）融合。使用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞。ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中McAb，

3、對(duì)分泌抗NF-M的McAb的細(xì)胞株以有限稀釋法進(jìn)行克隆化。獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。以競(jìng)爭(zhēng)抑制，免疫學(xué)方法對(duì)該McAb亞類進(jìn)行鑒定。以NF-M多肽為競(jìng)爭(zhēng)抗原應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)檢測(cè)McAb的特異性。將正常大鼠大腦組織勻漿后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體為一抗，進(jìn)行Westernblot試驗(yàn)，檢測(cè)抗體與大腦組織中的NF-M特異性結(jié)合的能力。以正常大鼠大腦作石蠟切片，以雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗

4、體為一抗，進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)，進(jìn)一步鑒定該單克隆抗體的特異性。
　　 結(jié)果:BALB/c小鼠經(jīng)腹腔免疫4次后，ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)為1(∶)512000。經(jīng)細(xì)胞融合后，融合率為46.61％，ELISA檢測(cè)抗體陽(yáng)性率7.26％。對(duì)分泌抗NF-M的陽(yáng)性細(xì)胞株有限稀釋法克隆化3～5次后，單克隆孔抗體分泌陽(yáng)性率達(dá)到100％，建立了一株能穩(wěn)定分泌抗NF-M的雜交瘤細(xì)胞株2C1。經(jīng)單克隆抗體亞類鑒定2C1所產(chǎn)生的抗體為IgG1。多肽競(jìng)爭(zhēng)

5、抑制結(jié)果:競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線為y=-0.4127x+0.2691，相關(guān)系數(shù)r=0.9912，證明McAb是針對(duì)NF-M的。Westernblot實(shí)驗(yàn)在160KD分子量附近可見(jiàn)一條清楚的蛋白條帶，與NF-M分子量大小相符。表明該McAb與正常大鼠大腦勻漿中的NF-M蛋白有較好的特異性反應(yīng)。正常大鼠大腦及脊髓石蠟切片的免疫組化結(jié)果顯示，神經(jīng)元胞核周?chē)睾稚w粒，表明該McAb與正常大鼠大腦切片組織中的NF-M有特異性反應(yīng)。
　　 結(jié)論