應力環(huán)境下成骨細胞差異基因表達及選擇性剪接調控研究.pdf

1、生命有機體受應力調節(jié)的生長一直是人們關注的問題。許多細胞都響應力信號，包括內皮細胞、成纖維細胞、成骨細胞、平滑肌細胞等。應力可能引起這些力效應細胞在基因水平或表達水平的調控。由于細胞內的應力信號轉導是一個異常復雜的過程，一系列的基因、受體和通路都參與其中，因此需要通過基因組水平的檢測手段全面分析應力信號的生物學功能和作用機制。本研究利用基因表達系列分析(Long SAGE)的方法檢測了應力刺激前后成骨細胞內的差異表達基因，并對這些基因進

2、行了生物信息學分析，包括功能分析、基因本體論(Gene Ontology，GO)分析和信號通路分析，根據生物信息學的研究結果構建了成骨細胞力信號轉導的調控網絡。
　　 應力刺激能夠改變成骨細胞內的基因表達，其中一種可能的機制是應力刺激對選擇性剪接的調控。真核生物的基因表達需要經歷轉錄后的修飾，才能產生成熟的mRNA進入胞漿，選擇性剪接是轉錄后修飾的一種重要手段。本研究應用分子生物學的檢測手段(實時定量PCR)鑒定了參與選擇性剪接

3、應力調控的剪接因子，檢測了過載拉伸前后剪接因子的表達水平。剪接因子調控剪接功能的發(fā)揮與其自身的磷酸化水平密切相關，本研究通過檢測過載拉伸前后剪接因子磷酸化激酶的表達，分析了參與選擇性剪接應力調控的可能的磷酸化通路。主要研究內容和結論如下：
　　 ①成骨細胞體外加載模型的構建：成骨細胞的原代培養(yǎng)及鑒定結果顯示，組織塊貼壁法獲取的成骨細胞形態(tài)良好具有成骨細胞的特征，可以用于后續(xù)試驗：設計制作過載拉伸裝置，本裝置可以對成骨細胞施加大應

4、變量的拉伸加載，加載后成骨細胞生長狀態(tài)良好，單次加載獲取細胞量大，能夠滿足基因組水平檢測的需要。
　　 ②對成骨細胞施加不同參數的過載拉伸刺激，檢測成骨細胞的生理行為：細胞周期檢測結果顯示，過載拉伸能夠改變成骨細胞細胞周期分布，促進成骨細胞的增殖；ALP檢測結果顯示，過載拉伸能夠抑制成骨細胞的分化；成骨細胞內鈣分泌檢測結果顯示，過載拉伸刺激能夠促進成骨細胞的礦化。
　　 ③對成骨細胞施加不同參數的過載拉伸刺激，檢測成骨細

5、胞內特異性基因的表達。結果顯示，過載拉伸能夠有效地調控成骨細胞的多種特異性基因的表達，從而對成骨細胞的生理行為，如增殖、分化和礦化進行調控。
　　 ④應用Long SAGE技術構建過載拉伸前后成骨細胞基因表達文庫，對兩個文庫進行對比分析。結果顯示，過載拉伸刺激后成骨細胞內顯著上調的基因有100個，顯著下調的基因有72個，表明應力刺激能夠有效地調節(jié)成骨細胞內的基因表達。
　　 ⑤應用實時定量PCR的方法對Long SAGE

6、文庫進行可靠性驗證。隨機選取的6個差異表達基因的PCR檢測結果與Long SAGE檢測結果一致，說明LongSAGE文庫提供的實驗數據是真實可靠的，可用于生物信息學分析。
　　 ⑥差異表達基因的生物信息學分析：功能分析結果顯示，受應力調控的差異表達基因主要調節(jié)細胞的蛋白質生物合成，信號轉導，代謝，離子結合，發(fā)育，凋亡，細胞粘附，細胞骨架，細胞增殖和細胞運動等功能；GO分析結果顯示，這些差異表達基因具有不同的GO分類和功能，同時應

7、力刺激也將通過調控這些差異表達基因來調控成骨細胞的各個生理過程和行為；KEGG信號通路分析結果顯示，差異表達基因參與的三條最主要的通路分別是核糖體通路，細胞粘附通路和細胞外基質-受體相互作用通路。
　　 ⑦根據過載拉伸前后成骨細胞內差異表達基因的生物信息學分析結果，構建了一個完整的、系統(tǒng)的成骨細胞響應細胞外應力刺激的信號轉導網絡，即細胞通過胞外基質感知應力刺激，隨后激活與細胞膜結合的如整合素，鈣離子通道，DAG，Wnt，BMP-

8、6/TGF-β受體；導致與之相關的幾種信號通路被激活，包括ECM-整合素通路，肌動蛋白通路，ERK1/2通路，BMP-6/TGF-β通路，Wnt通路，Ca2+調節(jié)通路和NO調節(jié)通路；最后這些力信號由細胞質傳遞進入細胞核，調節(jié)與前mRNA剪接相關的基因轉錄，細胞外基質組件，細胞骨架重組，成骨細胞增殖，分化和凋亡。
　　 ⑧選擇性剪接應力調控機制分析：應力調控剪接因子的鑒定，以SR蛋白(ASF/SF2和SC35)和hnRNP蛋白(h

9、nRNPA1)為研究對象，應用實時定量PCR手段檢測過載拉伸前后兩類剪接因子的表達。結果顯示，應力刺激對與選擇性剪接調控直接相關的兩類剪接因子SR蛋白和hnRNP蛋白都有顯著的調控作用，因此我們推測應力刺激可能通過剪接因子的表達來調控成骨細胞的剪接變異體表達；參與選擇性剪接應力調控的磷酸化通路分析，應用實時定量PCR的方法檢測了參與選擇性剪接過程中SR蛋白磷酸化和去磷酸化相關的激酶的表達。實驗結果顯示，無論是細胞質內起作用的SRPK激酶