鋰對體外培養(yǎng)的成年大鼠激活態(tài)雪旺細(xì)胞的增殖、存活及功能的影響.pdf

1、雪旺細(xì)胞(SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細(xì)胞,能夠合成和分泌細(xì)胞表面粘附因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和相關(guān)受體,以促進(jìn)軸突再生。雪旺細(xì)胞移植已被廣泛應(yīng)用于CNS脊髓損傷修復(fù)研究中。聯(lián)合其他手段移植雪旺細(xì)胞能夠更好得促進(jìn)軸突再生和功能恢復(fù)。激活態(tài)SCs是修復(fù)脊髓損傷最佳的種子細(xì)胞之一,其分泌的大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠改善損傷區(qū)的微環(huán)境,促進(jìn)損傷脊髓的功能恢復(fù)。體外培養(yǎng)SCs是自體移植的唯一途徑,因此獲得大量的保持其正常功能的SC

2、s是我們關(guān)注的焦點。近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)鋰能夠通過多種途徑抑制GSK3b,從而啟動促進(jìn)細(xì)胞生長的保護機制。鋰可以刺激干細(xì)胞、紋狀體和前腦細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖,是一種低誘變和低致癌劑。此外我們還注意到胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中白血病抑制因子能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和分型,而其中的2-巰基乙醇也可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖并且提高DNA的合成。因此本研究著眼于研究鋰劑和胚胎干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對SCs增殖、存活和功能的影響,并得到如下結(jié)果:
　　1.根據(jù)不

3、同類型細(xì)胞在覆層Lamminin的培養(yǎng)器皿上貼壁速度的差異,我們建立了一種簡便、快捷分離純化成年SCs的有效方法,獲得了大量高純度的自體SCs。純化培養(yǎng)至3d,5d,大部分雙極、三極樣細(xì)胞胞體發(fā)出較長的突起,平行排列成束狀。7-10d時基本融合成片。在細(xì)胞胞體及突起均有S100表達(dá)。培養(yǎng)5-10d,細(xì)胞增殖活性逐漸增高。7d時達(dá)最高峰,平穩(wěn)持續(xù)至10d緩慢下降,14d后呈明顯下滑趨勢。流式細(xì)胞儀檢測到純化后細(xì)胞純度可高達(dá)91％。

4、　　2.1mM和5mM氯化鋰能夠增強體外培養(yǎng)SCs的存活,其中5mM鋰濃度作用最強,而0.1mM氯化鋰則無此作用,高濃度10mM氯化鋰甚至?xí)a(chǎn)生毒性抑制作用,胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的SCs與1mM鋰作用效果接近,細(xì)胞生長狀態(tài)及速度優(yōu)于對照組SCs,但弱于5mM氯化鋰組。
　　3.相對于對照組而言,在不同時間點,5mM氯化鋰組與干細(xì)胞條件培養(yǎng)基均對成年大鼠激活態(tài)SCs增殖能力有著顯著的改善作用。
　　4.通過體外共培養(yǎng)模型,運用

5、免疫熒光標(biāo)記方法觀察鋰劑誘導(dǎo)的成年激活態(tài)大鼠SCs對胚胎DRGn(dorsal root ganglia neuron背根節(jié)神經(jīng)元)的軸突或突起生長的影響。與對照組相比,接觸培養(yǎng)組單個神經(jīng)元總突起和最長突起的平均長度均顯著增長,SCs能夠指引神經(jīng)元突起生長的方向,軸突沿著SCs胞膜及突起伸展的方向遷移并保持密切的接觸,提示細(xì)胞膜表面粘附分子是支持與引導(dǎo)神經(jīng)突起生長的重要因素。此外在接觸培養(yǎng)組,相較laminin基質(zhì)層而言,神經(jīng)元更加偏愛

6、SCs,絕大部分DRGn生長在SCs聚集區(qū)內(nèi)。同樣,SCs對中樞海馬神經(jīng)元也有促進(jìn)突起生長及引導(dǎo)支持的作用。
　　5.在SCs/DRG共培養(yǎng)7d時,SCs突起開始粘附并緊貼DRG神經(jīng)元突起生長,在此階段,大部分SCs聚集在DRG神經(jīng)元附近,胞體呈伸長樣,圍繞軸突延伸其細(xì)長突起。共培養(yǎng)10d后,培養(yǎng)物中開始出現(xiàn)MBP陽性表達(dá),但并非在所有SCs突起上都有表達(dá)。隨著時間的延長,在14d時,MBP陽性表達(dá)開始增強增多,可以看到大部分細(xì)胞

7、突起都有表達(dá)。此時在電鏡下觀察SCs可以形成許多質(zhì)膜包卷或納入大的軸突。可看見圍繞在SCs/軸突復(fù)合物的基板的形成。許多分化的SCs形成軸突系膜,松散包繞軸突至少2圈以上,形成幼稚型髓鞘。在SCs/DRG共培養(yǎng)35d時,光鏡下觀察到SCs包繞的軸突增粗增厚,形成明顯可見的黑色條帶(Fig.17A、B)。透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu),可看到緊密型髓鞘形成,約有十幾層緊密薄層包繞粗大的軸突,軸突內(nèi)散布有成束的小圓形微管。有許多細(xì)胞SCs以質(zhì)膜包