FasL的制備及其誘導(dǎo)EAE淋巴細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、為了闡明Fas-FasL在MS中介導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的刪除機(jī)理,我們進(jìn)行了下列三部分實(shí)驗(yàn).主要內(nèi)容和結(jié)果如下:第一部分,膜FasL的純化及其凋亡誘導(dǎo)功能的鑒定;我們應(yīng)用親和層析柱,從表達(dá)FasL的HepG2細(xì)胞膜蛋白抽提液中分離純化FasL分子.實(shí)驗(yàn)證明用本法純化的FasL分子量為31~33kD,SDS-PAGE呈現(xiàn)單一條帶,Western-Blot表明所提取的膜蛋白為人FasL.細(xì)胞學(xué)檢測(cè)該蛋白能誘導(dǎo)表達(dá)Fas的細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且在一

2、定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)量-效關(guān)系.第二部分,FasL胞外區(qū)(sFasL)基因的原核表達(dá)及其產(chǎn)物的免疫活性測(cè)定;我們將FasL胞外區(qū)編碼基因克隆入表達(dá)載體pQE-31,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)大量培養(yǎng),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),沉淀被裂解后,再經(jīng)Ni-NAT親和層析,制備了純度較高的sFasL蛋白,SDS-PAGE電泳顯示了在20kD處有一單一條帶,經(jīng)Western-Blotting鑒定,能與抗FasL抗體結(jié)合.隨后我們?cè)儆肞IERCE公司的內(nèi)毒素去除