耐比卡魯胺R3327前列腺癌細(xì)胞系雄激素抵抗的研究.pdf

1、研究背景:
　　在北歐和美國，前列腺癌目前已經(jīng)成為成年男性中最高發(fā)的惡性腫瘤，并且在多數(shù)西方國家中，導(dǎo)致男性癌癥患者死亡的惡性腫瘤排行榜中前列腺癌高居第二位，僅次于肺癌，僅僅在2013年美國就有超過29，000名男性患者死于前列腺癌。在我國前列腺癌患者發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢。而隨著科技的不斷進(jìn)步，篩查和診斷水平相應(yīng)快速提高，85％的早期前列腺癌患者都可以及早發(fā)現(xiàn)，這部分患者是幸運(yùn)的。該期病人接受放療或者根治性手術(shù)治療以后，在理論

2、上是可以達(dá)到完全治愈的效果。與之相反的是，很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)不屬于早期前列腺癌，這部分進(jìn)展期前列腺癌患者失去手術(shù)或者放療的機(jī)會(huì)，轉(zhuǎn)而進(jìn)行內(nèi)分泌治療。目前內(nèi)分泌治療的主要方法是應(yīng)用雄激素受體拮抗類藥物，如比卡魯胺、氟他胺等，初發(fā)的前列腺癌多是對(duì)內(nèi)分泌治療敏感，但經(jīng)過一段時(shí)間治療后，這部分激素依賴性前列腺癌多數(shù)要轉(zhuǎn)化為激素非依賴性前列腺癌(CRPC)，一旦轉(zhuǎn)變成為后者則患者預(yù)后極差，中位生存時(shí)間平均僅有16到18個(gè)月。對(duì)于CRPC患者的研究

3、從來沒有停止，但目前對(duì)這部分患者的中位生存時(shí)間改善并不明顯。
　　CRPC的形成機(jī)制目前仍不清楚，是前列腺癌研究方面的一個(gè)熱點(diǎn)。線粒體在其中發(fā)揮的作用逐漸引起重視。線粒體本身包含自己的基因組，并且是生命生存所需要的最基本的、同時(shí)也是相對(duì)比較復(fù)雜的細(xì)胞器。人體內(nèi)最基本生化反應(yīng)如:能量產(chǎn)生、凋亡、氨基酸和脂類的合成都在線粒體內(nèi)發(fā)生，因此，科學(xué)家們有理由懷疑線粒體的新陳代謝功能障礙或者功能失調(diào)可以導(dǎo)致腫瘤對(duì)藥物治療的反應(yīng)下降，并且增加腫

4、瘤的惡性程度和侵襲性。在前列腺癌方面現(xiàn)有研究證明，線粒體DNA(mtDNA)的突變，包括:點(diǎn)突變、多段缺失和DNA耗盡都可以加速腫瘤發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。特別是近年來有研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA的突變可以導(dǎo)致激素依賴性前列腺癌轉(zhuǎn)變成為激素非依賴性前列腺癌，而體外研究也進(jìn)一步證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)每減少10-100個(gè)mtDNA的拷貝就可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧耗量下降，整個(gè)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境由乏氧狀態(tài)變?yōu)楦哐鯛顟B(tài)，進(jìn)一步激活甲羥戊酸途徑和原癌基因Ras，繼發(fā)激活ERK，AKT

5、,NF-Kb和JNK途徑，使正常增殖的細(xì)胞發(fā)生突變，轉(zhuǎn)而表現(xiàn)出惡性表型。
　　研究目的:
　　本試驗(yàn)研究中，我們用治療量濃度的雄激素受體拮抗劑R-比卡魯胺長期體外培養(yǎng)前列腺癌雄激素敏感性細(xì)胞系R3327-H，通過多次傳代，最終成功誘導(dǎo)建立了R3327-H的亞系-耐R-比卡魯胺的R3327細(xì)胞亞系(R3327-Rbic)并檢測R3327-Rbic的細(xì)胞形態(tài)、侵襲性。將R-比卡魯胺與R3327-H和R3327-Rbic細(xì)胞進(jìn)行共

6、同培養(yǎng)后，運(yùn)用基因芯片技術(shù)，研究了在此過程中雄激素受體(AR)、線粒體DNA(mtDNA)基因突變的情況，比較了兩種細(xì)胞增殖過程中AR以及線粒體調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白Drp-1表達(dá)的變化情況，并應(yīng)用realtime RT-PCR技術(shù)，weston-blot技術(shù)驗(yàn)證基因測序所得出的結(jié)果，部分闡明了R3327-H前列腺癌細(xì)胞由激素敏感性轉(zhuǎn)變成為激素抵抗性過程中mtDNA、AR的突變情況，明確了這一過程中氧化呼吸鏈相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)建立了R-比卡

7、魯胺耐受性前列腺癌細(xì)胞系R3327-Rbic及R-比卡魯胺耐受細(xì)胞系的動(dòng)物模型，進(jìn)一步來研究了雄激素敏感性細(xì)胞系R3327-H在R-比卡魯胺的作用下產(chǎn)生藥物耐受性的機(jī)理，從而為今后的對(duì)于CRPC的研究奠定了理論基礎(chǔ)，為CRPC的患者的進(jìn)一步治療提供細(xì)胞系和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為CRPC的治療提供便利條件。
　　研究方法:
　　1、R-比卡魯胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞R3327-H和R3327-Rbic的作用及R3327-Rbic細(xì)胞的特性:

8、
　　1)應(yīng)用電子顯微鏡觀察R-比卡魯胺作用于R3327-H后形成的R3327-Rbic細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面發(fā)生的變化。
　　2)R-比卡魯胺在兩種細(xì)胞中濃度不斷增加，達(dá)到20Lmol/l治療濃度后應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)法研究R-比卡魯胺對(duì)R3327-H和R3327-Rbic兩種細(xì)胞系的抑制作用，并根據(jù)觀察結(jié)構(gòu)繪制細(xì)胞隨藥物濃度變化而生成的抑制率曲線。
　　3)應(yīng)用流式細(xì)胞儀研究在R-比卡魯胺作用下R3327-H和R3327-

9、Rbic兩種細(xì)胞系所處細(xì)胞周期情況。
　　4)應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測R-比卡魯胺對(duì)R3327-H和R3327-Rbic兩種細(xì)胞系腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　2、R3327-Rbic細(xì)胞對(duì)R-比卡魯胺耐受的機(jī)理研究
　　1)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)（q-PCR技術(shù)）檢測R-比卡魯胺作用后R3327-Rbic細(xì)胞系內(nèi)線粒體的兩種重要功能區(qū)D-Loop和CO2的mtDNA含量的變化。
　　2)應(yīng)用re

10、altime RT-PCR技術(shù)研究雄激素受體(AR)及線粒體呼吸鏈相關(guān)12s，16s核糖體RNA、MT-ND2、MT-ND4和MT-ND6、細(xì)胞色素B、ATP6等多肽的mRNA的表達(dá)情況。
　　3)應(yīng)用Illumina Sequencing程序完成對(duì)R3327鼠的基因測序，獲得的數(shù)據(jù)加入基因庫，對(duì)R3327-Rbic細(xì)胞進(jìn)行基因測序，比較基因突變情況。
　　4) weston-blot技術(shù)檢測R-比卡魯胺作用于兩種細(xì)胞增殖整

11、個(gè)過程中AR及Drp-1蛋白表達(dá)情況，以驗(yàn)證基因測序所得出的結(jié)果。
　　3、R-比卡魯胺耐受的鼠前列腺癌R3327-Rbic模型建立的研究
　　1)應(yīng)用Martigel等輔助手段在哥本哈根鼠（R3327鼠）體內(nèi)建立細(xì)胞的體內(nèi)R3327-H和R3327-Rbic兩種細(xì)胞的成瘤動(dòng)物模型。
　　2)應(yīng)用已經(jīng)成瘤的動(dòng)物模型分為R3327-H、R3327-Rbic、R3327-H\Rbic、R3327-Rbic\Rbic四組，來

12、研究R-比卡魯胺耐受性和非耐受性細(xì)胞模型在R-比卡魯胺作用下腫瘤體積大小
　　3)獲得成瘤動(dòng)物模型瘤體，用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)比較兩種細(xì)胞體內(nèi)凋亡水平的表達(dá)差異。
　　研究結(jié)果:
　　1、R-比卡魯胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞R3327-H和R3327-Rbic的作用及R3327-Rbic細(xì)胞的特性:
　　1)R-比卡魯胺作用于R3327-H細(xì)胞5天后細(xì)胞生長就被明顯抑制。這種情況持續(xù)了24個(gè)周，24個(gè)周后細(xì)胞

13、又開始復(fù)制。可以分離出新的細(xì)胞，叫做R3327-Rbic細(xì)胞，這種細(xì)胞生長速度更快，與R3327-H相比，倍增時(shí)間由50小時(shí)縮減到25小時(shí)。兩種細(xì)胞都具有典型細(xì)胞形態(tài)，有特征性的核，清晰可見的核膜，有多個(gè)核仁的染色體結(jié)構(gòu)。高倍鏡下可以顯示后者線粒體形態(tài)發(fā)生細(xì)微的變化，包括管狀形態(tài)和線粒體嵴增大。
　　2) MTT檢驗(yàn)用來分析增加R-比卡魯胺濃度對(duì)R3327-H及R3327-Rbic的影響。生存曲線顯示，R3327細(xì)胞在0.02μ

14、mol/l濃度的R-比卡魯胺溶液中生存率就表現(xiàn)出濃度依賴性的抑制，半數(shù)抑制濃度為0.7μ mol/l。但是，R-比卡魯胺對(duì)R3327-Rbic細(xì)胞的生長影響較小，僅僅在濃度達(dá)到20μ mol/l的情況下曲線才有所下降。這說明治療劑量下的R-比卡魯胺對(duì)于R3327-Rbic的增殖已經(jīng)失去調(diào)控作用，細(xì)胞對(duì)藥物已經(jīng)不敏感。
　　3)通過流式細(xì)胞儀測定兩種細(xì)胞周期顯示，與對(duì)照組相比，R3327-H細(xì)胞多處于G1期，比例達(dá)到61％，而R33

15、27-Rbic細(xì)胞大多數(shù)處于S期，比例可達(dá)到28％，這表明R-比卡魯胺可抑制R3327-H組細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期限制在G1期，而對(duì)R3327-Rbic細(xì)胞則多數(shù)位于增殖活躍的S期，說明R3327-Rbic細(xì)胞對(duì)R-比卡魯胺的抑制作用已不再有反應(yīng)。
　　4) Transwell實(shí)驗(yàn)檢測穿透膜的細(xì)胞數(shù)量，這種能力可以反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。通過對(duì)兩組細(xì)胞透膜細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)在400倍高倍視野下，正常細(xì)胞穿膜數(shù)為（60.2±6.23）個(gè)，R

16、3327-H組細(xì)胞為（35.2±7.55）個(gè)(p＜0.05)，R3327-Rbic組細(xì)胞為(56.2±4.73)個(gè)(p＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明雖然經(jīng)過R-比卡魯胺處理，但R3327-Rbic組細(xì)胞的體外侵襲能力未受明顯影響，而R3327-H組細(xì)胞穿膜能力大大下降，侵襲力明顯減弱。
　　2、R3327-Rbic細(xì)胞對(duì)R-比卡魯胺耐受的機(jī)理研究
　　1)用超螺旋敏感的qPCR方法來觀察R-比卡魯胺對(duì)兩組細(xì)胞mtDNA的含量以及

17、mtDNA相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明兩種細(xì)胞和模板mtDNA中D-Loop和CO2mtDNA的含量差別不大，均保持在較低水平，這表明R-比卡魯胺對(duì)于兩組細(xì)胞mtDNA的結(jié)構(gòu)影響微乎其微。但是，在預(yù)熱模板中檢測D-LOOP和CO2基因的拷貝數(shù)量后可以發(fā)現(xiàn)R3327-Rbic組較R3327-H組明顯下降，這預(yù)示經(jīng)過R-比卡魯胺處理后的R3327-Rbic細(xì)胞總mtDNA數(shù)量是下降的。
　　2) realtime RT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)呼

18、吸鏈復(fù)合體的一系列基因進(jìn)行檢測，可以很明確的發(fā)現(xiàn)，R3327-Rbic細(xì)胞的這些基因的mRNA水平較R3327-H細(xì)胞下降的。其中12s基因表達(dá)下降最少，而ND6基因表達(dá)下降最多。R3327-Rbic細(xì)胞的AR基因表達(dá)相對(duì)R3327-H細(xì)胞是1.8，而R3327-H細(xì)胞在經(jīng)過R-比卡魯胺處理后Drp-1的表達(dá)明顯增加，超過了R3327-Rbic細(xì)胞中的表達(dá)，而R-比卡魯胺對(duì)后者中Drp-1的表達(dá)幾乎沒有影響。
　　3)Illu m

19、ina基因測序平臺(tái)檢測R3327細(xì)胞的線粒體DNA和AR，并將R3327-Rbic細(xì)胞的線粒體DNA的基因組檢測結(jié)果與之比較，觀察基因突變情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體DNA中ATP6 T8993位點(diǎn)突變，AR中T877A位點(diǎn)突變。
　　4)通過weston-blot方法檢測了兩種細(xì)胞中雄激素受體(AR)水平和Drp-1蛋白表達(dá)水平。R3327-Rbic組細(xì)胞中AR表達(dá)水平較R3327-H組細(xì)胞增加，但同時(shí)Drp-1水平卻較R3327-H組

20、下降。
　　3、R-比卡魯胺耐受的鼠前列腺癌R3327-Rbic模型建立的研究
　　1)應(yīng)用兩種細(xì)胞系背側(cè)種植在哥本哈根鼠（R3327鼠）體內(nèi)建立細(xì)胞的體內(nèi)R3327-H和R3327-Rbic兩種細(xì)胞的成瘤動(dòng)物模型。R3327-H組接種成瘤比例80％（8/10只），R3327-Rbic組接種成瘤比例70％（7/10只）。
　　2)研究R-比卡魯胺耐受性和非耐受性細(xì)胞動(dòng)物模型自然進(jìn)程和在R-比卡魯胺作用下瘤體積大小。比較

21、發(fā)現(xiàn)，R3327-H組、R3327-Rbic組和R3327-Rbic\Rbic三組之間瘤體大小差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而R3327-H\Rbic組瘤體與前三組相比瘤體明顯偏小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3)取出腫瘤標(biāo)本，用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)比較兩種細(xì)胞體內(nèi)凋亡水平的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:熒光顯微鏡下觀察經(jīng)DAPI染色后各標(biāo)本細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R3327-H組、 R3327-Rbic

22、組和R3327-Rbic\Rbic三組細(xì)胞凋亡陽性率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，R3327-H\Rbic組細(xì)胞凋亡陽性率明顯高于其他三組。
　　研究結(jié)論:
　　1、R-比卡魯胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞R3327-H和R3327-Rbic的體外作用及其相關(guān)機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MTT檢驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測證明R-比卡魯胺對(duì)于R3327-Rbic的增殖已經(jīng)失去調(diào)控作用，細(xì)胞對(duì)該藥物已經(jīng)不敏感，Transwell實(shí)驗(yàn)證明R3327-Rbic的體外侵襲能力基本

23、未受R-比卡魯胺作用影響。
　　2、RT-PCR研究表明R-比卡魯胺對(duì)于兩組細(xì)胞mtDNA的結(jié)構(gòu)影響較小，但R3327-Rbic細(xì)胞總mtDNA數(shù)量是下降的。多種實(shí)驗(yàn)方法可以驗(yàn)證R3327-Rbic組細(xì)胞中AR表達(dá)水平較R3327-H組細(xì)胞增加，但同時(shí)R3327-H組經(jīng)比卡魯胺作用后Drp-1水平卻明顯上升，具體原因尚待進(jìn)一步的研究。線粒體DNA中ATP6T8993位點(diǎn)突變，AR中T877A位點(diǎn)突變。證明mtDNA和AR基因突變參