雜色鮑幼苗“掉板癥”病原及致病機(jī)制研究.pdf

1、2001～2006年間，廣東、福建、海南和臺(tái)灣沿海養(yǎng)殖的雜色鮑(Haliotisdiversicolor Reeve)在育苗過程中陸續(xù)暴發(fā)大規(guī)模不明原因死亡，主要表現(xiàn)為鮑幼體附著于附著基(波紋板、薄膜等)后第7～20天出現(xiàn)大量死亡，這種鮑苗從附著基上脫落死亡的現(xiàn)象，鮑養(yǎng)殖業(yè)內(nèi)稱之為“掉板癥”或“脫板癥”。我們從育苗環(huán)境的理化因子和生物因子著手，分析病因，排除了環(huán)境理化因子、寄生蟲等的直接影響；超微切片結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)病毒粒子。而在對(duì)發(fā)病期鮑

2、苗培育環(huán)境中的細(xì)菌數(shù)量的分析中發(fā)現(xiàn)，發(fā)病前后細(xì)菌數(shù)量有顯著變化，推測鮑幼苗的發(fā)病跟細(xì)菌有關(guān)系。通過分離純化，從病鮑體內(nèi)獲得了一株毒力很強(qiáng)的病原菌，命名為菌株NA0301，菌株NA0301的48 hr半致死濃度LD50=2.25×106 CFU/mL。經(jīng)生理生化特性鑒定和16S rDNA、rpoA基因等分子標(biāo)記的序列分析，最終鑒定病原菌株NA0301為溶珊瑚弧菌(Vibrio corallilyticus)。回歸感染試驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)溶珊瑚弧菌

3、NA0301是雜色鮑幼苗“掉板癥”的主要致病菌之一。
　　 rpo A基因是一個(gè)看家基因，在同一弧菌屬不同種間的變異度在一般在88％～98％間，相似度小于88％一般屬于不同屬的菌株。本研究據(jù)此建立了一套可行的弧菌鑒定方法。本研究除了應(yīng)用分析rpo A基因來鑒定弧菌外，在菌株NA0301的rpo A基因序列分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并合成了一套環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)特異性強(qiáng)的引物，成功建立了對(duì)溶珊瑚弧菌LAMP檢測方法，檢測特異性強(qiáng)，與

4、多種其他病原弧菌、腸道菌以及環(huán)境菌均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，檢測靈敏度高，基因組DNA的最低檢測限小于66fg；細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測限為36 CFU/mL。
　　 溶珊瑚弧菌NA0301的胞外產(chǎn)物具有強(qiáng)的生理活性，具有蛋白酶活性、溶血活性和淀粉酶活性。其中，在鹽度為2.6％，pH為10.0，溫度為28℃的培養(yǎng)條件下溶血活性最強(qiáng)。分析了胞外產(chǎn)物在不同條件下的酶活力穩(wěn)定性，胞外產(chǎn)物在煮沸10min或60℃溫浴1 hr的實(shí)驗(yàn)條件下，均可同時(shí)失去溶

5、血酶、淀粉酶、蛋白酶活性；37℃水浴2 hr以上酶活性下降。菌株NA0301能分泌鐵載體，該鐵載體對(duì)鐵離子的絡(luò)合力介于鎘天青和8-羥基喹啉之間。胞外產(chǎn)物對(duì)鮑具有毒性，能在48hr內(nèi)致使實(shí)驗(yàn)鮑死亡。胞外產(chǎn)物和洗滌后的菌體的毒性試驗(yàn)結(jié)果比較表明，胞外產(chǎn)物在菌株NA0301對(duì)鮑的致病過程中起著重要作用。組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)研究結(jié)果顯示，病原菌入侵鮑體后，主要靶器官為肝組織、唾液腺、外套膜；4hr后即可在肝組織、唾液腺、外套膜等組織中發(fā)現(xiàn)病

6、原弧菌NA0301。病鮑的鰓絲、肝組織、肌絲、消化腺等有不同程度的受損，各組織中出現(xiàn)空泡化，呈現(xiàn)明顯的病理損傷特征。鮑在注射感染了菌株NA0301后，部分免疫因子呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，在注射感染病原菌的第1、2 hr，AKP和ACP酶活力均比對(duì)照組低，當(dāng)注射感染后第6～48 hr，AKP和ACP酶活力均大幅上升，明顯高于對(duì)照組。SOD和POD活力在注射2hr內(nèi)和注射后8hr以后，活力水平均明顯低于對(duì)照組。這4種主要免疫因子的酶活力變化表

7、明雜色鮑的血淋巴在病原菌NA0301開始入侵體內(nèi)時(shí)即發(fā)揮了重要的作用，伴隨著釋放出大量與免疫清除相關(guān)的水解酶ACP、AKP、POD、SOD等，可以通過測定鮑血清中ACP、AKP等部分免疫因子來推算鮑的非特異性免疫水平。本研究初步闡明了溶珊瑚弧菌對(duì)鮑的致病機(jī)制以及感染病原菌后鮑的部分免疫因子變化規(guī)律。
　　 藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶珊瑚弧菌NA0301對(duì)利福平、氯霉素和環(huán)丙沙星等高度敏感，對(duì)萬古霉素、克林霉素等有強(qiáng)耐藥抗性。中草藥