兒童呼吸道標(biāo)本肺炎支原體基因型研究.pdf

1、研究背景:
　　 肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae,MP)是介于細(xì)胞與病毒之間,無細(xì)胞壁的一類原核細(xì)胞型生物,是引起兒童氣管炎、支氣管炎、原發(fā)性不典型肺炎的重要病原體,也是引起成年人社區(qū)獲得性肺炎的常見病原之一。MP感染具有流行性,通常3-7年有一次流行高峰。人類感染MP后,一般具有2-10年的免疫力。
　　 MP主要通過對呼吸道粘膜上皮細(xì)胞的黏附和定植感染宿主。其黏附過程由MP的特殊頂端結(jié)構(gòu)黏附細(xì)胞

2、器完成,其中P1蛋白被認(rèn)為是肺炎支原體的主要黏附素。早年基于P1基因重復(fù)序列不同的研究,將MP分為Ⅰ、Ⅱ兩個(gè)基因型。隨后,Dorigo-Zetsma等分別在臨床分離株Ⅰ型株和Ⅱ型株中分離到5種亞型和3種亞型。Dorigo-Zetsma等又對MP臨床分離株進(jìn)行了測序,發(fā)現(xiàn)了P1基因Ⅰ型和Ⅱ型的特異序列可能發(fā)生重組。此外,關(guān)于MP-P1基因出現(xiàn)變異的報(bào)道也屢有出現(xiàn)。臨床上,近幾年MP肺炎的發(fā)病率不斷升高,并且常常出現(xiàn)難治性肺炎支原體肺炎(R

3、efractoryM.pneumoniaepneumonia,RMPP)的相關(guān)報(bào)道。但是否與MP亞型的改變有關(guān),目前尚缺乏明確的定論。
　　 目前,雖然國外已有少數(shù)關(guān)于MP亞型及P1基因變異的報(bào)道,但國內(nèi)尚無相關(guān)報(bào)道。因此,我們采用MP感染兒童的鼻咽吸出物(Nasopharyngealaspirate,NPA)作為標(biāo)本,對MP基因進(jìn)行分型研究并對MP肺炎患兒的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,旨在了解MP亞型的流行狀況以及MP亞型與臨床的相

4、互關(guān)系。
　　 目的:
　　 根據(jù)MPP1黏附蛋白基因限制性酶切圖譜對MP感染兒童NPA標(biāo)本進(jìn)行MP基因分型研究,旨在了解MP的流行狀況以及MP亞型與臨床的相互關(guān)系。
　　 方法:
　　 本研究以2009年2月-2009年12月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院呼吸科因MPP住院患兒的NPA(共300例)作為研究對象,對其進(jìn)行MP分型及測序。
　　 1.收集患兒的NPA;提取MPDNA,進(jìn)行熒光定量PCR

5、。選取經(jīng)PCR熒光探針法測定濃度1.0*10^4以上(包括1.0*10^4)NPA作為下一步實(shí)驗(yàn)標(biāo)本,4000轉(zhuǎn)/15分鐘離心后取上清于1.5ml離心管中放入-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?br>　　 2.設(shè)計(jì)引物ADH1/ADH2和ADH3/ADH4,進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),對P1基因進(jìn)行擴(kuò)增;取15μ1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠(含1μg/ml的溴化乙啶)中進(jìn)行電泳并用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。
　　 3.限制性片段

6、長度多態(tài)性(RFLP)分析,分別用HaeⅢ(或HhaⅠ、HpaⅡ、Sau3A)限制性內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng);取酶切產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳并用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果。
　　 4.挑選部分P1-Ⅰ型和P1-Ⅱ型標(biāo)本以及MP-129標(biāo)準(zhǔn)株和MP-FH標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行PCR反應(yīng),將其產(chǎn)物送公司進(jìn)行測序。
　　 5.采集并比較不同型別MP感染患兒的下列臨床資料:性別、年齡、臨床表現(xiàn)、并發(fā)疾病、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

7、及治療情況等。
　　 結(jié)果:
　　 1.用P1基因ADH1/ADH2和ADH3/ADH4特異引物擴(kuò)增MP-129、MP-FH標(biāo)準(zhǔn)株和300例MP臨床標(biāo)本,分別得到2280bp和2580bp大小的基因片段;
　　 2.在用HaeⅢ限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)后,MP-129和297例臨床標(biāo)本產(chǎn)生了P1-Ⅰ型的特征性條帶,MP-FH和3例臨床標(biāo)本產(chǎn)生了P1-Ⅱ型的特征性條帶;
　　 3.經(jīng)過PCR-R

8、FLP實(shí)驗(yàn)分析,所有P1-Ⅰ型臨床標(biāo)本均為1b亞型,P1-Ⅱ型臨床標(biāo)本均為2a亞型;
　　 4.測序結(jié)果顯示P1-Ⅰ型臨床標(biāo)本基因序列與標(biāo)準(zhǔn)株MP-129P1基因序列完全相同僅1例出現(xiàn)了非同義點(diǎn)突變:在核酸序列第208位點(diǎn)處出現(xiàn)了點(diǎn)突變(G→A),導(dǎo)致第70位點(diǎn)的氨基酸從P變?yōu)镾;P1-Ⅱ型臨床標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)株MP-FHP1基因序列完全相同;
　　 5.對臨床資料分析發(fā)現(xiàn)3例P1-Ⅱ型患兒均為重癥MPP患兒,經(jīng)過大環(huán)內(nèi)酯類藥