GnRH類似物對卵巢癌和卵巢功能的雙重調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其死亡率占婦科惡性腫瘤的首位。雖然手術(shù)方式、化療、放射治療等手段不斷改進，但5年生存率仍徘徊在30％-40％，而且發(fā)病年齡日趨年輕化。近年來，隨著人們健康意識的提高、檢查手段的進步，很多早期卵巢癌被及時發(fā)現(xiàn)和診治。怎樣使患者得到更有效、更安全的治療，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，保護年輕患者的生殖內(nèi)分泌功能成為卵巢癌研究的新熱點。
　　 “促性腺激素理論”認為促性腺激素對卵巢癌生長起促進作用。

2、促性腺激素釋放激素(GnRH)對促性腺激素的降調(diào)節(jié)作用在理論上能夠抑制卵巢癌的生長和增殖。GnRH是下丘腦釋放的十肽激素，主要作用是調(diào)控垂體卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)的合成與分泌，維持正常的生殖系統(tǒng)功能。由于GnRH的半衰期很短，一般應(yīng)用其類似物(包括激動劑和拮抗劑)來進行相關(guān)研究和應(yīng)用?；A(chǔ)研究報道GnRH激動劑或拮抗劑能夠抑制體外培養(yǎng)的卵巢癌細胞生長，提示GnRH類似物在H-P-O軸外也有作用。有研究推測軸外作用是通過

3、GnRH受體(GnRHR)產(chǎn)生的。哺乳動物GnRHR有兩型：GnRHR1和GnRHR2。另一方面，研究顯示青春期前的兒童暴露于化療藥物造成卵巢功能損害的比例只有10％。提示臨床上可以人為創(chuàng)造暫時的青春期前環(huán)境，保護卵巢功能免受化療藥物的損害。GnRH能夠抑制H-P-O軸，抑制FSH和LH的分泌，使卵巢功能處于青春期前水平，理論上能夠?qū)β殉补δ芷鸬奖Ｗo作用?？姑缋展芗に?AMH)是卵巢顆粒細胞分泌的糖蛋白激素，研究提示AMH能夠抑制卵泡的

4、初始募集和循環(huán)募集，調(diào)控卵泡發(fā)育的過程，是能夠早期反應(yīng)卵巢功能的指標。本研究從體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗兩方面證實GnRH類似物的抑制卵巢癌和保護卵巢功能的雙重調(diào)節(jié)作用，并比較GnRH激動劑和拮抗劑的作用差異。這將為臨床選擇應(yīng)用GnRH激動劑或拮抗劑治療卵巢癌、保護卵巢功能提供實驗依據(jù)。本研究分別選用GnRH激動劑goserelin和拮抗劑cetrorelix作為實驗藥物。
　　 課題共分四個部分：1.GnRH類似物對卵巢癌細胞

5、生長、增殖的影響；2.人卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)，檢測GnRH類似物對顆粒細胞分泌AMH、E2和P的影響；3.GnRH類似物對裸鼠皮下移植瘤和裸鼠卵巢功能的雙重調(diào)節(jié)作用；4.臨床資料研究，分析GnRHR與卵巢癌臨床分期和病理分級的相關(guān)性。
　　 第一部分GnRH類似物對卵巢癌細胞生長、增殖的影響
　　 目的:研究GnRH類似物對卵巢癌細胞生長、增殖的影響。
　　 方法:用RT-PCR方法檢測卵巢癌細胞株ES-2和SK

6、OV3-ip上GnRHR1和GnRHR2基因的表達。分別用不同濃度(0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)GnRH激動劑goserelin或拮抗劑cetrorelix作用于ES-2和SKOV3-ip細胞，24 h后用磺基羅丹明染色(SRB)法檢測細胞增殖情況。分別用10-5mol/L goserelin或cetrorelix作用于ES-2和SKOV3-ip細胞14天，觀察細胞集落形成情況。應(yīng)用流式細胞儀分析10

7、-5mol/L goserelin或cetrorelix作用于ES-2或SKOV3-ip細胞24 h后對細胞周期的影響。蛋白印跡法檢測10-5mol/L goserelin或cetrorelix作用于ES-2和SKOV3-ip細胞24 h后，對細胞周期蛋白cyclinB1和cyclinD1表達的影響。以及10-5mol/L goserelin或cetrorelix作用不同時間(0、15、30、60、120、240 min)對ES-2和S

8、KOV3-ip細胞pAKT蛋白表達的影響。
　　 結(jié)果:ES-2和SKOV3-ip細胞株均表達GnRHR1和GnRHR2。SRB結(jié)果提示GnRH激動劑和拮抗劑均不同程度抑制了ES-2和SKOV3-ip細胞的增殖，且濃度越高抑制越明顯。在ES-2細胞株，10-5mol/L cetrorelix的抑制作用比10-5mol/Lgoserelin更明顯。10-5mol/L goserelin或cetrorelix能抑制卵巢癌細胞株ES-

9、2和SKOV3-ip集落形成；在SKOV3-ip細胞株，cetrorelix的抑制作用大于goserelin。細胞周期結(jié)果提示goserelin和cetrorelix均能略微增加S期細胞比例，但差異沒有統(tǒng)計學意義。Goserelin和cetrorelix均能使ES-2和SKOV3-ip細胞周期蛋白cyclin B1的表達降低，使cyclin D1的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義。蛋白印跡法檢測提示10-5mol/L goserelin或ce

10、trorelix作用達2 h及以上均能抑制ES-2和SKOV3-ip細胞pAKT蛋白的表達。
　　 結(jié)論:ES-2和SKOV3-ip細胞株均表達GnRHR1和GnRHR2。GnRH激動劑和拮抗劑均能抑制卵巢癌細胞株ES-2和SKOV3-ip的生長和增殖。
　　 第二部分 GnRH類似物對卵巢顆粒細胞分泌AMH、E2和P的影響
　　 目的:研究GnRH類似物對卵巢顆粒細胞分泌AMH、E2和P的影響。
　　

11、方法:用免疫細胞化學方法檢測原代分離培養(yǎng)的人卵巢顆粒細胞上Calretinin、Inhibinα、EMA、Vimentin、CD99、Desmin、CD34的表達，并進行油紅染色和H-E染色鑒定顆粒細胞。用免疫細胞化學方法檢測顆粒細胞上GnRHR1和GnRHR2的表達情況。分別用順鉑(DDP)、goserelin、goserelin+DDP、cetrorelix或cetrorelix+DDP處理顆粒細胞24 h后，用ELISA方法檢測顆

12、粒細胞分泌AMH的水平，用化學發(fā)光法檢測顆粒細胞分泌E2和P的水平。
　　 結(jié)果:免疫細胞化學方法證明顆粒細胞上存在GnRHR1和GnRHR2表達。Goserelin能上調(diào)顆粒細胞分泌AMH的水平，cetrorelix能明顯上調(diào)顆粒細胞分泌AMH的水平；但goserelin和cetrorelix對E2和P的分泌無明顯影響。
　　 結(jié)論顆粒細胞上存在GnRHR1和GnRHR2表達。GnRH類似物能上調(diào)顆粒細胞AMH的分泌。

13、
　　 第三部分 GnRH類似物對裸鼠皮下移植瘤和卵巢功能的雙重調(diào)節(jié)作用
　　 目的:研究GnRH類似物對裸鼠皮下移植瘤和卵巢功能的雙重調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:ES-2細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代后調(diào)整濃度為2.5×107/ml取0.2 ml注射于36只裸鼠右側(cè)肩胛區(qū)皮下，隨機分為6組。處理如下：(1)生理鹽水(NS)組：皮下注射NS0.1 ml/天；一周后腹腔注射NS0.2 ml/周。(2)DDP組：皮下注射NS0.1 m

14、l/天；一周后腹腔注射5 mg/kg DDP(稀釋至0.2 ml)/周。(3)goserelin組：皮下注射100μg goserelin(稀釋至0.1 ml)/天；一周后腹腔注射NS0.2 ml/周。(4)goserelin+DDP組：皮下注射100μg goserelin(稀釋至0.1 ml)/天；一周后腹腔注射5 mg/kg DDP(稀釋至0.2 ml)/周。(5)cetrorelix組：皮下注射100μg cetrorelix(

15、稀釋至0.1 ml)/天；一周后腹腔注射NS0.2 ml/周。(6)cetrorelix+DDP組：皮下注射100μg cetrorelix(稀釋至0.1 ml)/天；一周后腹腔注射5 mg/kg DDP(稀釋至0.2 ml)/周。比較各組裸鼠體重、移植瘤體積、移植瘤組織Ki-67表達情況、動情周期、血AMH、FSH、E2和P的分泌、卵巢各級卵泡比例和卵巢體積的差異。卵巢組織和移植瘤切片H-E染色觀察病理形態(tài)學變化。
　　 結(jié)果

16、:各組裸鼠體重變化無明顯差異。用藥第12天開始，DDP組、goserelin組、goserelin+DDP組、cetrorelix組、cetrorelix+DDP組腫瘤體積均明顯小于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義。DDP組、goserelin組和goserelin+DDP組移植瘤組織Ki-67的表達明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義。與空白對照組比較，goserelin組、goserelin+DDP組和cetrorelix組的動情次數(shù)明

17、顯減少；goserelin+DDP組動情周期時間明顯延長。Goserelin組裸鼠血中AMH的表達明顯高于空白對照組，各組裸鼠血中FSH、E2和P的變化無明顯統(tǒng)計學差異。Goserelin組卵泡閉鎖率明顯小于DDP組。Goserelin組、goserelin+DDP組、cetrorelix組和cetrorelix+DDP組原始卵泡+竇前卵泡率明顯高于DDP組。病理形態(tài)學觀察到DDP組卵巢組織間質(zhì)纖維化明顯，卵泡數(shù)量減少，竇前卵泡減少，各

18、級卵泡均出現(xiàn)較高比例閉鎖?？瞻讓φ战M移植瘤增殖活躍、分化差、并出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論:Goserelin或cetrorelix能抑制裸鼠皮下移植瘤生長和增殖同時上調(diào)AMH分泌、減少裸鼠動情次數(shù)、延長動情周期、增加原始卵泡+竇前卵泡率，保護卵巢功能。
　　 第四部分 GnRHR在上皮性卵巢癌組織中的表達及其與卵巢癌臨床分期、病理分級的關(guān)系
　　 目的:研究GnRHR(GnRHR1和GnRHR2)在上皮性卵巢癌組織

19、中的表達及其與卵巢癌臨床分期、病理分級的關(guān)系。
　　 方法:用免疫組織化學的方法分別檢測GnRHR1和GnRHR2在54例上皮性卵巢癌組織中的表達，分別統(tǒng)計分析GnRHR1、GnRHR2表達量與卵巢癌臨床分期和病理分級及腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 結(jié)果:GnRHR1在Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌組織中的表達明顯高于Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌。GnRHR2在Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌組織中的表達亦明顯高于Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌。GnRHR2在高分化的卵巢癌組織中的表達明顯

20、高于中分化和低分化的卵巢癌組織。GnRHR1在不同病理分級的卵巢癌組織中的表達無明顯統(tǒng)計學差異。GnRHR1和GnRHR2在卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達無明顯統(tǒng)計學差異。GnRHR1和GnRHR2之間在表達量上無明顯相關(guān)性。
　　 結(jié)論:GnRHR1和GnRHR2在卵巢癌組織中廣泛表達。GnRHR1和GnRHR2在Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌中表達較高。GnRHR2在高分化的卵巢癌中的表達較高。GnRHR1和GnRHR2與卵巢癌生長、增殖密切