Rho激酶信號通路對大鼠動脈粥樣硬化形成的影響及法舒地爾的心血管保護(hù)作用.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病，排在發(fā)病率和死亡率首位。高脂血癥是引起AS的重要而獨立的危險因子之一。有研究報道，由高脂血癥誘發(fā)的大動脈的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)可出現(xiàn)在高脂飼料喂養(yǎng)后的幾天之內(nèi)，遠(yuǎn)較脂質(zhì)條紋出現(xiàn)要早。炎癥因子及氧化應(yīng)激產(chǎn)物均可通過多種途徑刺激血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖，在AS晚期纖維化斑塊的形成過程中起著重要作

2、用。因此抗炎、抗氧化應(yīng)激治療已成為預(yù)防和治療AS的重要手段。
　　 Rho激酶(Rho kinase，ROCK)介導(dǎo)了包括肌動蛋白骨架形成、細(xì)胞收縮、細(xì)胞粘附與遷移、基因表達(dá)、增殖凋亡等多種細(xì)胞功能。ROCK的高表達(dá)或過度激活與許多心血管疾病，如高血壓、再狹窄、AS、肺動脈高壓、腦血管痙攣、缺血再灌注損傷的發(fā)生有關(guān)。他汀類藥物的“多效性”作用，即調(diào)脂以外的抗炎、改善內(nèi)皮功能等作用，被證明至少部分是通過抑制Rho激酶途徑介導(dǎo)的。因

3、此，Rho激酶已成為臨床上多種心血管疾病的治療靶點。法舒地爾(fasudil，F(xiàn)as)是第一個也是惟一應(yīng)用于臨床的Rho激酶抑制劑，主要用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血所致的腦血管痙攣及相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)缺血癥狀。在許多已開展的臨床前期研究中，發(fā)現(xiàn)法舒地爾對包括冠狀動脈痙攣、高血壓、肺動脈高壓、冠脈再通手術(shù)后的再狹窄和AS在內(nèi)的多種心血管疾病均有良好的治療作用，長期使用未見明顯副作用。同時作為一種選擇性Rho激酶抑制劑，法舒地爾也常常被作為體內(nèi)、外研

4、究的工具來探討Rho激酶的生理和病理作用。
　　 近年來有關(guān)Rho激酶信號通路與AS關(guān)系的報道逐年增加，但Rho激酶通路在高脂血癥階段與炎癥和氧化應(yīng)激的關(guān)系，以及對氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL，ox-LDL)誘導(dǎo)的VSMC增殖影響的研究尚未見報道。本實驗采用選擇性Rho激酶抑制劑法舒地爾作為工具，研究了：(1)Rho激酶信號通路對高脂血癥大鼠炎癥反應(yīng)的影響；(2)Rho激酶信號通路對高脂血癥大鼠氧化應(yīng)激的影響；(

5、3)Rho激酶信號通路對ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響。
　　 第一部分 Rho激酶信號通路對高脂血癥大鼠炎癥反應(yīng)的影響及法舒地爾的抗炎作用研究
　　 目的：探討 Rho激酶信號通路在高脂血癥大鼠炎癥反應(yīng)中的作用及法舒地爾的抗炎作用。
　　 方法：清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，體重170～210g，隨機(jī)分成5組：正常對照組、模型對照組、法舒地爾低劑量組、法舒地爾高劑量組及辛伐他汀

6、組，每組6只。除正常對照組外，其余各組大鼠喂飼高膽固醇飼料（high cholesterol diet，HCD），連續(xù)30d。給予HCD14d后，法舒地爾低、高劑量組分別給予法舒地爾10、30mg/kg/d，分兩次腹腔注射給藥，辛伐他汀組灌胃給予辛伐他汀10mg/kg/d，模型對照組腹腔注射生理鹽水0.1ml/kg/d，治療共持續(xù)14d。停藥、停食24h后，斷頭取血，分離血清，留取主動脈，分別測定下列指標(biāo)：(1)空腹血脂：分別測定總膽固

7、醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)，高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL)；(2)血清炎癥因子：分別測定白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6，白細(xì)胞介素-8（IL-6），C-反應(yīng)蛋白（C-reaction prote

8、in，CRP）和可溶性細(xì)胞間粘附分子(solubleintercellular adhesion molecule，sICAM);(3)反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測主動脈核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)p65亞單位及ROCK mRNA的表達(dá)；(4)Western blot測定主動脈磷酸

9、化的肌球蛋白輕鏈磷酸酶靶亞基(phosphorylated myosin phosphatase target subunit，p-MYPT)-1的表達(dá)，以示ROCK活性變化；(5)免疫組化法檢測主動脈壁內(nèi)NF-κB p65亞單位的表達(dá)和定位；(6)主動脈組織病理學(xué)檢測：觀察主動脈炎癥變化。
　　 結(jié)果：
　　 1 空腹血脂：與正常對照組相比，模型對照組血清TC和LDL-C水平明顯增高（均P＜0.05），而TG和HDL-

10、C水平明顯降低（均P＜0.05）。與模型對照組相比，給予辛伐他汀明顯降低了TC和LDL-C水平（均P＜0.05），并升高了HDL-C水平（P＜0.05），對TG沒有影響。兩個劑量的法舒地爾均明顯降低了TC的水平（均P＜0.05），高劑量組更加明顯；高劑量的法舒地爾明顯升高了HDL-C的水平；兩個劑量的法舒地爾均有降低TG的趨勢，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異；法舒地爾對LDL-C沒有產(chǎn)生影響。
　　 2 血清炎癥因子水平：與正常對照組相比，模

11、型對照組的血清CRP，sICAM，IL-6和IL-8均有明顯升高（均P＜0.05）；辛伐他汀治療明顯降低了CRP，sICAM，IL-6，和IL-8的水平（均P＜0.05），兩個劑量的法舒地爾均明顯降低了sICAM，IL-6和IL-8的水平（均P＜0.05），但只有高劑量的法舒地爾明顯降低了CRP水平（P＜0.05）。
　　 3 主動脈ROCK mRNA表達(dá)和蛋白活性的變化：RT-PCR結(jié)果顯示模型對照組主動脈內(nèi)ROCK mRNA

12、表達(dá)較正常對照明顯增高（P＜0.05），經(jīng)辛伐他汀和法舒地爾干預(yù)后，Rho激酶mRNA表達(dá)較模型對照組明顯下降(均P＜0.05)。
　　 Western blot結(jié)果顯示模型對照組主動脈內(nèi)p-MYPT1蛋白水平較正常對照組明顯上調(diào)(P＜0.05)；與模型對照組相比，辛伐他汀和法舒地爾明顯抑制了p-MYPT1蛋白的表達(dá)（均P＜0.05）。
　　 4 主動脈NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)及定位：RT-PCR結(jié)果顯示，與正常

13、對照組比較，模型對照組NF-κB p65亞單位mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)。而經(jīng)辛伐他汀和法舒地爾干預(yù)后，NF-κB p65亞單位mRNA表達(dá)顯著下降(均P＜0.05)。
　　 5 主動脈組織病理學(xué)檢查：模型對照組大鼠主動脈壁的內(nèi)膜和中膜較正常對照組有增厚，經(jīng)辛伐他汀和法舒地爾干預(yù)后，組織學(xué)變化有顯著改善。
　　 結(jié)論：在高膽固醇血癥大鼠的炎癥反應(yīng)中，伴有Rho激酶信號通路的激活；選擇性Rho激酶抑制劑法舒地爾

14、可阻斷該通路，抑制NF-κB的激活和轉(zhuǎn)位，進(jìn)而影響炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用；法舒地爾還可改善高膽固醇血癥大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂。
　　 第二部分 Rho激酶信號通路對高脂血癥大鼠氧化應(yīng)激的影響及法舒地爾
　　 目的：研究Rho激酶信號通路在高脂血癥大鼠氧化應(yīng)激中的作用及法舒地爾的抗氧化作用。
　　 方法：清潔級雄性SD大鼠40只，體重170～210g，隨機(jī)分成4組：正常對照組、模型對照組、法舒地爾低劑量及高劑量組

15、，每組10只。除正常對照組外，其余各組大鼠喂飼HCD，連續(xù)30d。給予HCD14d后，法舒地爾低、高劑量組分別給予法舒地爾10、30mg/kg/d，分兩次腹腔注射給藥，模型對照組腹腔注射給予生理鹽水0.1ml/kg/d，治療共持續(xù)14d。停藥、停食24h后，記錄每只動物體重，然后斷頭取血，分離血清，留取心臟、肝臟，分別測定下列指標(biāo)：(1)空腹血清TC水平；(2)血清抗氧化酶活性及一氧化氮(nitric oxide，NO)水平：抗氧化酶包

16、括過氧化氫酶(catalase，CAT)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，Gpx);(3) Western blot測定心臟組織中p-MYPT1和一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的表達(dá)；(4)心臟組織中抗氧化酶活性及NO水平：制備心臟組織勻漿，分別測定CAT、SOD和Gpx的活

17、性和NO水平；(5)心臟指數(shù)和心臟組織病理學(xué)檢查：稱取整個心臟重量，計算心臟指數(shù)=心臟重量/體重；切取部分心臟組織做常規(guī)HE染色，觀察心臟組織炎癥變化；(6)肝臟指數(shù)和肝臟組織病理學(xué)檢查：稱取整個肝臟重量，計算肝臟指數(shù)=肝臟重量/體重；切取部分肝臟組織做常規(guī)HE染色，觀察肝臟組織學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1 血清TC水平：與正常對照組相比，模型對照組TC水平明顯增高(P＜0.05)；與模型對照組相比，法舒地爾治療明顯

18、降低了TC水平(均P＜0.05)，但未達(dá)正常水平。
　　 2 血清抗氧化酶活性：與正常對照組相比，模型對照組抗氧化酶CAT、SOD和Gpx的活性均有顯著降低（均P＜0.05）；兩個劑量的法舒地爾治療均極大地提高了CAT、SOD和Gpx的活性（均P＜0.05）。
　　 3 心臟組織中p-MYPT1水平的變化：在模型對照組大鼠的心臟組織中，p-MYPT1水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)；而經(jīng)兩個劑量的法舒地爾干預(yù)，其水

19、平得到明顯抑制（均P＜0.05）。
　　 4 心臟組織中抗氧化酶活性：與血清檢測結(jié)果相似，與正常對照組相比，模型對照組心臟組織內(nèi)抗氧化酶CAT、SOD和Gpx的活性均有顯著降低（均P＜0.05）；兩個劑量的法舒地爾顯著提高了CAT、SOD和Gpx的活性(均P＜0.05)。
　　 5 血清和心臟組織中NO及心臟組織中eNOS表達(dá)的變化：模型對照組大鼠血清和心臟組織內(nèi)的NO水平，均明顯低于正常對照組（均P＜0.05）；與模型

20、對照組相比，法舒地爾兩個劑量組大鼠血清和心組織內(nèi)的NO水平均有顯著提高（均P＜0.05）。
　　 模型對照組大鼠心臟內(nèi)eNOS表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P＜0.05)；經(jīng)法舒地爾干預(yù)后，eNOS表達(dá)量顯著提高（均P＜0.05）。
　　 6 心臟、肝臟指數(shù)及組織病理學(xué)檢測：各組之間心臟指數(shù)未見明顯差異；心臟組織學(xué)檢查：肉眼觀察，各組之間未見明顯差異。鏡下觀察，模型對照組大鼠心肌細(xì)胞增粗，間質(zhì)內(nèi)結(jié)締組織增多，并有組織水腫；

21、法舒地爾治療組大鼠，心肌細(xì)胞腫脹和間質(zhì)內(nèi)組織水腫均有明顯改善。
　　 與正常對照組相比，模型對照組肝臟指數(shù)有明顯增高(P＜0.05)；法舒地爾治療組與模型對照組相比，肝臟指數(shù)明顯降低。肉眼觀察，正常對照組大鼠肝臟顏色鮮紅，表面光滑，質(zhì)脆柔軟；模型對照組大鼠肝臟明顯腫大，并呈黃褐色，觸之有油膩感，而法舒地爾治療組肝腫大減輕，顏色較紅。鏡下觀察，模型對照組大鼠有明顯的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)有彌散分布的空泡狀脂滴，嚴(yán)重

22、者融合為大脂滴，將細(xì)胞核推向一側(cè)；匯管區(qū)見少量炎細(xì)胞浸潤。法舒地爾治療后，肝細(xì)胞脂肪變性程度明顯減輕，胞漿內(nèi)脂滴明顯較少。
　　 結(jié)論：Rho激酶活性在高脂血癥大鼠心臟組織內(nèi)明顯增高，介導(dǎo)了氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能的損傷；Rho激酶抑制劑法舒地爾可通過抑制該通路的激活，提高機(jī)體的抗氧化能力并改善內(nèi)皮功能。
　　 第三部分 Rho激酶信號通路對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響
　　 目的：研究Rho激

23、酶信號通路對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響
　　 方法：采用組織貼塊法分離培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC，取4～6代細(xì)胞用于實驗。用法舒地爾（0.1、1.0及10μM）預(yù)孵細(xì)胞1小時后，給予ox-LDL(50mg/L)刺激至24h。采用MTT法檢測VSMC增殖活性；上清液檢測SOD、MDA含量；用Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMP)-2和MMP

24、-9蛋白的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：給予ox-LDL(50mg/L)刺激，VSMC細(xì)胞增殖活性顯著提高，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量增多，上清液中SOD含量下降，而MDA水平增高；用0.1μM的法舒地爾預(yù)處理除使MMP-2表達(dá)降低外，未明顯改變上述其他指數(shù)，1μM和10μM的法舒地爾預(yù)處理，可顯著抑制VSMC的增值活性，減少MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)，提高SOD活性，降低MDA含量。
　　 結(jié)論：Rho激酶信號通路介

25、導(dǎo)了ox-LDL所誘導(dǎo)的VSMC增殖，抑制該通路可提高VSMC的抗氧化能力、下調(diào)MMP2和MMP-9蛋白的表達(dá)，從而抑制VSMC的增殖。
　　 結(jié)論
　　 1 在高脂血癥大鼠的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)中伴有Rho激酶信號通路的激活，并與內(nèi)皮功能紊亂有關(guān)。
　　 2 選擇性Rho激酶抑制劑法舒地爾可阻斷Rho激酶信號通路，影響NF-κB的激活和轉(zhuǎn)位發(fā)揮抗炎作用，并可改善脂質(zhì)代謝紊亂；法舒地爾還可提高機(jī)體的抗氧化能力并