抗血管生成促肝癌轉(zhuǎn)移中IL-12b介導(dǎo)的機(jī)體免疫起關(guān)鍵作用.pdf

1、晚期肝細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱(chēng)“肝癌”)在臨床上常見(jiàn)，以索拉非尼為代表的抗血管生成藥物在晚期肝癌治療中占重要地位，但其生存期延長(zhǎng)有限且多數(shù)患者因各種原因需要停藥。有報(bào)道稱(chēng)，短期抗血管生成治療后停藥具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能。我們前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，索拉非尼在顯示療效的同時(shí)，促進(jìn)肝癌局部播散和血道轉(zhuǎn)移，腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞在其中起重要作用。盡管越來(lái)越多的研究提示抗血管生成存在治療耐藥和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等負(fù)面作用，但多集中以腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的變化來(lái)解釋該作用。

2、本研究擬在機(jī)體內(nèi)環(huán)境方面，揭示兩種典型的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(索拉非尼和蘇尼替尼)的作用，了解該作用對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的影響，揭示其機(jī)制并尋求潛在的聯(lián)合治療，以減少其負(fù)面作用，從而為抗血管生成治療增效或減少停藥后的反跳。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)：
　　1.為充分暴露藥物對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的作用，我們使用藥物預(yù)處理模型，即在接種腫瘤前用藥，接種腫瘤后停藥?？寡苌伤幬镱A(yù)處理不影響原位種植肝癌的生長(zhǎng)，但可顯著促進(jìn)原位種植的肝癌或尾靜脈注射肝癌細(xì)胞

3、的肺轉(zhuǎn)移。這與Ebos等(Ebos，et al.Cancer Cell2009)的報(bào)道一致。在我們的研究體系中，只有動(dòng)物的機(jī)體暴露于藥物，腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織未受到藥物的直接影響。我們推測(cè)，藥物可引發(fā)裸鼠機(jī)體發(fā)生某種變化，該變化促進(jìn)了后來(lái)進(jìn)入體內(nèi)的肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。
　　2.使用抗體芯片篩選動(dòng)物血漿中濃度顯著變化的常見(jiàn)炎癥因子和血管生成因子，發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)使外周血血漿白介素(IL)-12b(IL-12的一個(gè)亞基，又稱(chēng)IL-12p40)

4、濃度顯著下降，使用ELISA方法驗(yàn)證了該結(jié)果。
　　3.確定IL-12b的器官來(lái)源：取動(dòng)物的腎、肝、脾、肺4個(gè)主要臟器，發(fā)現(xiàn)這些臟器的il-12b表達(dá)均被藥物治療所抑制，其中脾臟il-12b的表達(dá)豐度最高。
　　4.確定IL-12b的細(xì)胞來(lái)源：磁珠分選小鼠脾臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞是il-12b的主要來(lái)源(分選后剩余的其他細(xì)胞il-12b的表達(dá)量較低)。這與傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)一致，即抗原提呈細(xì)胞是表達(dá)IL-1

5、2的主要細(xì)胞類(lèi)型。
　　5.選擇體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞為主要的研究對(duì)象，抗血管生成藥物在體外可顯著抑制THP-1單核-巨噬細(xì)胞株的il-126表達(dá)；在此基礎(chǔ)上，我們探索在藥物預(yù)處理促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象中，IL-12b表達(dá)降低是否是關(guān)鍵原因。
　　6.IL-12b的水平下降是否有促轉(zhuǎn)移作用
　　1)脾臟切除：脾臟il-12b表達(dá)量最高，切脾后的動(dòng)物外周血血漿il-12b濃度明顯低于同期的接受假手術(shù)的小鼠。對(duì)切脾后的裸鼠尾靜脈注

6、射肝癌細(xì)胞，可觀察到該組動(dòng)物肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移增加；
　　2)小鼠IL-12b中和抗體腹腔注射亦可促進(jìn)尾靜脈肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均重現(xiàn)了抗血管生成藥物的促肝癌肺轉(zhuǎn)移作用。
　　7.IL-12b表達(dá)的下降如何促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移：體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組IL-12b對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力無(wú)明顯影響；現(xiàn)有知識(shí)也提示IL-12主要通過(guò)自然殺傷細(xì)胞(NK)的細(xì)胞毒作用起間接的抗腫瘤作用(Trinchieri，Nat Rev Immunol20

7、03)。我們采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK的干擾素(IFN)-γ表達(dá)，可觀察到了抗血管生成藥物可以顯著抑制動(dòng)物外周血NK細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)。這提示，抗血管生成藥物可能通過(guò)抑制IL-12b的表達(dá)，間接抑制NK細(xì)胞的免疫殺傷作用。
　　8.臨床研究發(fā)現(xiàn)，癌周肝臟組織內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較多或巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)較高的患者，接受根治性切除術(shù)后預(yù)后不佳。巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子是獨(dú)立預(yù)測(cè)患者死亡和復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。
　　9.潛在干預(yù)：如

8、上結(jié)果提示，針對(duì)巨噬細(xì)胞的靶細(xì)胞的干預(yù)存在一定的治療價(jià)值。藥物干預(yù)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用有望為抗血管生成藥物增效，臨床研究的結(jié)果甚至提示，即使單純干預(yù)巨噬細(xì)胞的功能亦可能抑制肝癌轉(zhuǎn)移。再者，多個(gè)報(bào)道顯示唑來(lái)膦酸可通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞和DC的抗腫瘤免疫，我們前期的研究(Zhang，et al.Clin Cancer Res2010)也提示唑來(lái)膦酸在免疫微環(huán)境方面與索拉非尼有協(xié)同作用。我們選取唑來(lái)膦酸為進(jìn)一步的聯(lián)合干預(yù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，唑來(lái)膦酸

9、可以逆轉(zhuǎn)抗血管生成藥物引起的脾臟il-12b表達(dá)下降。體外實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，唑來(lái)膦酸在特定濃度時(shí)可以逆轉(zhuǎn)蘇尼替尼對(duì)THP-1細(xì)胞的il-12b表達(dá)抑制作用。在抗血管生成藥物預(yù)處理時(shí)，聯(lián)用唑來(lái)膦酸可以抑制抗血管生成藥物治療對(duì)肝癌肺轉(zhuǎn)移的促進(jìn)。
　　結(jié)論：抗血管生成治療可以抑制機(jī)體，特別是巨噬細(xì)胞的IL-12b的表達(dá)，該作用介導(dǎo)抗血管生成治療促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的潛能。針對(duì)其干預(yù)可有望成為抗血管生成藥物的聯(lián)合治療或停藥后的替代治療，以期減少抗血管生

10、成治療的負(fù)面作用，提高療效。
　　應(yīng)用價(jià)值：
　　1.以往研究抗血管生成治療的促癌轉(zhuǎn)移作用的機(jī)制，多用腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的變化來(lái)解釋?zhuān)欢疚陌l(fā)現(xiàn)藥物可引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境變化，尤其是免疫力的變化，是更為關(guān)鍵的因素。這提示，患者在接受靶向VEGFR的抗血管生成治療時(shí)，患者的機(jī)體免疫變化值得關(guān)注。
　　2.首次篩選并驗(yàn)證了參與促癌轉(zhuǎn)移作用的關(guān)鍵分子IL-12b，且巨噬細(xì)胞是其主要來(lái)源，以后者為靶細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)臨床可用的藥物(唑來(lái)膦

11、酸)可以逆轉(zhuǎn)其功能，從而減少抗血管生成治療的負(fù)面作用，提高其臨床療效。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.以往有研究探索抗血管生成的促轉(zhuǎn)移的負(fù)面作用，但多使用腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的變化來(lái)解釋該負(fù)面作用。本研究揭示了機(jī)體內(nèi)環(huán)境在接受治療時(shí)的變化，并闡述了機(jī)體的變化參與構(gòu)成抗血管生成藥物的促轉(zhuǎn)移負(fù)面作用，豐富了抗血管生成治療耐藥的機(jī)制。
　　2.篩選獲得并驗(yàn)證了參與促成負(fù)面作用的關(guān)鍵分子IL-12b，并發(fā)現(xiàn)唑來(lái)膦酸可針對(duì)該分子進(jìn)行干預(yù)