CD248在人腦膠質(zhì)瘤微血管周細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律及其介導(dǎo)周細(xì)胞促血管生成作用的研究.pdf

1、腫瘤血管生成在腫瘤的生長(zhǎng)、演進(jìn)及轉(zhuǎn)移等方面有著重要的作用，因此，針對(duì)腫瘤的抗血管生成具有重要意義。惡性膠質(zhì)瘤由于生長(zhǎng)部位的特殊性及生長(zhǎng)的侵襲性，外科手術(shù)根治難度大，而放療和化療效果亦不理想。因此，針對(duì)膠質(zhì)瘤的抗血管生成治療則顯得尤為重要。腫瘤微血管中主要有內(nèi)皮細(xì)胞和其周?chē)闹芗?xì)胞，目前的抗血管生成藥物主要針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞，比如Bevacizumab和Sunitinib等。研究表明，這些藥物在多種腫瘤中都取得了較好的治療效果。然而，在一些體積

2、較大的腫瘤中，這些藥就達(dá)不到理想的結(jié)果。這是因?yàn)獒槍?duì)內(nèi)皮細(xì)胞的治療會(huì)使微血管密度下降，但是血管的周細(xì)胞覆蓋率反而上升了。因此，周細(xì)胞也應(yīng)是抗血管生成治療的靶細(xì)胞。研究周細(xì)胞在血管中的作用對(duì)同時(shí)針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的抗血管生成治療具有重要的意義。
　　周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞作用，能穩(wěn)定新形成的內(nèi)皮細(xì)胞小管，能調(diào)節(jié)血流和血管的通透性，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活。周細(xì)胞能分化為多種間質(zhì)細(xì)胞。如在血管增大過(guò)程中，周細(xì)胞可分化為血管平滑

3、肌細(xì)胞；在損傷修復(fù)及炎癥過(guò)程中，周細(xì)胞可從血管壁脫落，分化為能產(chǎn)生Ⅰ型膠原的纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞；另外，有報(bào)道稱(chēng)周細(xì)胞能分化為纖維母細(xì)胞，成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞。周細(xì)胞的來(lái)源多樣，并且，在不同的組織器官，其來(lái)源也有區(qū)別。周細(xì)胞標(biāo)志物在不同的物種、不同的組織中會(huì)有不同，在不同的發(fā)育階段也會(huì)有差異。目前，可作為鑒定周細(xì)胞的標(biāo)記物主要有NG2、RGS5、PDGFRβ、desmin、α-SMA、3G5神經(jīng)節(jié)苷脂、Slug、XlacZ4及氨基肽

4、酶N等。眾所周知，腫瘤組織間質(zhì)與正常組織間質(zhì)明顯不同，這種不同也包含了腫瘤微血管周細(xì)胞。為了能更好地研究腫瘤微血管周細(xì)胞，需要一個(gè)能特異表達(dá)在其上的分子。而新近研究表明，CD248/Endosialin/TEM1是一個(gè)在腫瘤微血管周細(xì)胞上高表達(dá)的分子，而在正常組織微血管周細(xì)胞上并不表達(dá)。這就為更好研究腫瘤微血管周細(xì)胞提供了可能。
　　CD248是單次跨膜糖蛋白，已發(fā)現(xiàn)了四個(gè)與其作用的配體，分別是纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原及轉(zhuǎn)

5、移相關(guān)蛋白Mac-2BP/90K。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，CD248表達(dá)在各種組織(肺、腎、脾、肝等)間質(zhì)纖維母細(xì)胞及血管上。并且，隨著胚胎的發(fā)育，CD248的表達(dá)逐漸下降。在成體組織中，CD248在子宮及腎小球中表達(dá)較高，輸卵管血管也有少量表達(dá)，心、肺表達(dá)更低，而其他組織則幾乎不表達(dá)。另外，在內(nèi)皮祖細(xì)胞中，也可見(jiàn)CD248表達(dá)。CD248在多種腫瘤中均有表達(dá)，如肉瘤，腦腫瘤，乳腺癌，皮膚癌、結(jié)腸癌等。
　　在本研究中，我們首先利用新鮮

6、標(biāo)本冰凍切片，進(jìn)行兔抗人CD248抗體和鼠抗人CD31抗體及兔抗人CD248抗體和鼠抗人α-SMA抗體免疫熒光雙標(biāo)，證實(shí)CD248的確是膠質(zhì)瘤微血管周細(xì)胞特異表達(dá)的標(biāo)志物。其次，利用118例石蠟組織切片，研究CD248的表達(dá)在膠質(zhì)瘤中的臨床病理意義。為了更好研究CD248在腫瘤血管生成中的作用，我們利用CD248特異表達(dá)在腫瘤微血管周細(xì)胞上的特點(diǎn)，結(jié)合免疫磁珠的方法，分離膠質(zhì)瘤微血管周細(xì)胞，并經(jīng)免疫組織化學(xué)、免疫熒光和RT-PCR的方法

7、得到驗(yàn)證。隨后利用慢病毒轉(zhuǎn)染CD248干擾序列到周細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光、RT-PCR、Western blot的方法驗(yàn)證干擾效果；用劃痕實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)觀察CD248對(duì)周細(xì)胞的影響。在周細(xì)胞CD248干擾前后對(duì)腫瘤血管生成的影響實(shí)驗(yàn)中，把CD248干擾前后的周細(xì)胞分別與U87細(xì)胞混合后注入裸鼠皮下，觀察腫瘤大小及腫瘤血管生成情況。最終確認(rèn)CD248為針對(duì)腫瘤微血管周細(xì)胞的抗血管生成治療的一個(gè)良好靶點(diǎn)。
　　主要結(jié)果:
　　一、

8、CD248特異表達(dá)在膠質(zhì)瘤微血管周細(xì)胞上，且其表達(dá)與患者性別、年齡無(wú)關(guān)，而與膠質(zhì)瘤的分級(jí)相關(guān)。在12例人腦原代膠質(zhì)瘤新鮮標(biāo)本中，對(duì)其中8例高表達(dá)CD248的標(biāo)本進(jìn)行CD248和CD31及CD248和α-SMA免疫熒光雙標(biāo)染色。結(jié)果顯示，CD248表達(dá)在細(xì)胞膜上，CD31也表達(dá)在細(xì)胞膜上，但是兩者表達(dá)在不同的細(xì)胞上。CD248陽(yáng)性細(xì)胞在CD31陽(yáng)性細(xì)胞的周?chē)?。?SMA表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)，它與CD248表達(dá)在相同的細(xì)胞上。由于CD31為內(nèi)皮細(xì)

9、胞標(biāo)記，而α-SMA為周細(xì)胞標(biāo)記，因此，上述結(jié)果表明：CD248表達(dá)在膠質(zhì)瘤微血管周細(xì)胞上，而不表達(dá)在微血管內(nèi)皮細(xì)胞上。因此，可以把CD248作為膠質(zhì)瘤微血管周細(xì)胞的一個(gè)特異性標(biāo)記分子。為了更好地了解CD248在膠質(zhì)瘤周細(xì)胞中的表達(dá)情況，我們對(duì)118例膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)WHOⅠ級(jí)6例均不表達(dá)，Ⅱ級(jí)39例中有15例表達(dá)(表達(dá)率38.46％)，Ⅲ級(jí)37例中有26例表達(dá)(表達(dá)率70.27％)、Ⅳ級(jí)36例中有27例表達(dá)(表達(dá)率

10、75％)。Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤與Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤相比，無(wú)顯著差異(P＞0.05)；Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤與Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤相比，均有非常顯著差異(P＜0.01)；而Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤之間CD248的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　二、成功分離、培養(yǎng)和鑒定了膠質(zhì)瘤微血管周細(xì)胞。我們運(yùn)用兔抗人CD248多克隆抗體標(biāo)記膠質(zhì)瘤微血管周細(xì)胞，再運(yùn)用免疫磁珠的方法，獲得了一群細(xì)胞。免疫組化染色結(jié)果顯示，這群細(xì)胞表達(dá)CD248，不表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)記分子CD31及膠質(zhì)細(xì)

11、胞標(biāo)記GFAP。免疫熒光結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤中僅含有少量CD248陽(yáng)性細(xì)胞，大部分為GFAP陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。免疫磁珠分離后所得到的細(xì)胞，大部分為CD248陽(yáng)性細(xì)胞。在分離得到的細(xì)胞中，CD248與PDGFR-β共表達(dá)于細(xì)胞膜上，也與NG2共表達(dá)在細(xì)胞膜上。分離所得的周細(xì)胞純度為91.0±5.6％。RT-PCR結(jié)果顯示，分離所得細(xì)胞的條帶長(zhǎng)度約為230bp，與預(yù)計(jì)的條帶吻合，即分離所得細(xì)胞含有CD248的mRNA。在ECM膠中，周

12、細(xì)胞能形成小管樣結(jié)構(gòu)；在三維支架中，周細(xì)胞能沿著膠原支架生長(zhǎng)，形成小管結(jié)構(gòu)。
　　三、發(fā)現(xiàn)下調(diào)CD248表達(dá)可抑制周細(xì)胞增殖和遷移。利用CD248shRNA慢病毒顆粒感染周細(xì)胞。免疫熒光染色顯示，與對(duì)照組相比，CD248shRNA干擾后的周細(xì)胞CD248表達(dá)明顯下調(diào)；RT-PCR結(jié)果顯示，CD248干擾后的周細(xì)胞mRNA大約下降了50％；Western blot結(jié)果表明，CD248干擾后的周細(xì)胞CD248的表達(dá)明顯下降。抑制CD2

13、48的功能后，周細(xì)胞的遷移能力明顯下降；干擾CD248分子在周細(xì)胞上的表達(dá)后，亦能明顯降低周細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD248干擾后，周細(xì)胞增殖能力明顯下降。
　　四、證實(shí)了CD248參與膠質(zhì)瘤移植瘤血管生成。下調(diào)周細(xì)胞CD248表達(dá)后，與U87細(xì)胞一起注入裸鼠皮下。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，腫瘤體積縮小(P=0.022)，血管密度下降(P=0.021)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但微血管直徑?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

14、=0.769)。這說(shuō)明CD248促進(jìn)周細(xì)胞參與腫瘤血管生成。可能機(jī)制為CD248與細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原作用，促進(jìn)周細(xì)胞增殖，使周細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶9，引起血管外基質(zhì)的降解，利于周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，進(jìn)而形成更多的新生血管。
　　五、CD248活化后能促進(jìn)周細(xì)胞招募相關(guān)受體的表達(dá)，推測(cè)其在周細(xì)胞上的作用與周細(xì)胞招募有關(guān)。轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白Mac-2BP/90K刺激對(duì)照組周細(xì)胞后，TGFRβⅠ，TGFRβⅡ，

15、PDGFRβ，EDG-1在mRNA水平上均有大幅上升，尤其是在刺激后12小時(shí)達(dá)到頂峰。而Mac-2BP/90K刺激CD248干擾后的周細(xì)胞后，TGFRβⅠ，TGFRβⅡ，EDG-1在mRNA水平上未見(jiàn)明顯升高，僅PDGFRβmRNA有一定的升高。周細(xì)胞的招募在腫瘤血管生成中具有重要作用，因此，CD248的激活，能促進(jìn)腫瘤的血管生成。
　　上述結(jié)果表明，CD248在腫瘤中的高表達(dá)與腫瘤惡性程度有關(guān)，它具有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用，抑制