支氣管哮喘病人T細(xì)胞及其亞群自噬觀察.pdf

1、成熟T淋巴細(xì)胞根據(jù)表面標(biāo)志分為CD4<'+>和CD8<'+>T淋巴細(xì)胞。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，CD4<'+>T淋巴細(xì)胞在哮喘病人中可使多種白細(xì)胞自血液募集至氣道，并引起嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的炎癥介質(zhì)釋放。且近期的實(shí)驗(yàn)已從細(xì)胞水平證實(shí)哮喘中Th1/Th2失衡的存在，認(rèn)為哮喘是一種免疫失衡性疾病，其Th2型免疫反應(yīng)異常增強(qiáng)，而Th1型免疫反應(yīng)卻異常減弱，并伴隨一系列的細(xì)胞因子的產(chǎn)生異常及氣道內(nèi)變態(tài)反應(yīng)性炎癥的發(fā)生。而Th1、Th2細(xì)胞正是由

2、CD4<'+>T淋巴細(xì)胞繼續(xù)分化而成。因此，誘導(dǎo)CD4<'+>T淋巴細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性或凋亡成為支氣管哮喘預(yù)防和治療的方向之一。 另外，在大鼠模型中已證實(shí)，MHC Ⅰ類分子限制性的Tc1和Tc0細(xì)胞克隆在體內(nèi)可抑制IgE的產(chǎn)生，提示Tc亞群也參與調(diào)節(jié)傳統(tǒng)上認(rèn)為由Th2介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)。目前對(duì)哮喘尤其是慢性哮喘的發(fā)生機(jī)制提出了T細(xì)胞假說(shuō)：患者體內(nèi)存在著針對(duì)某些變應(yīng)原或病毒性抗原的記憶T細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體接觸過(guò)敏原或受病毒感染后，變應(yīng)原或病毒性抗

3、原循環(huán)至肺部，再次刺激肺部的特異性記憶T細(xì)胞，從而誘發(fā)持續(xù)的哮喘。一般認(rèn)為，變應(yīng)原誘導(dǎo)Th細(xì)胞反應(yīng)，而病毒誘導(dǎo)Tc細(xì)胞反應(yīng)，均能招引和激活嗜酸性粒細(xì)胞并引起隨后的粘膜損傷，誘發(fā)IgE的產(chǎn)生，引起嗜酸性脫屑性支氣管炎、粘液分泌過(guò)度、血管平滑肌收縮。故通過(guò)應(yīng)用細(xì)胞因子或細(xì)胞因子抗體使Trh/Tc細(xì)胞的分化向Th1、Tc1漂移，可能為防治本病提供新的策略。 細(xì)胞凋亡是目前被普遍公認(rèn)的一種程序性細(xì)胞死亡，但程序性細(xì)胞死亡并不僅僅是細(xì)胞

4、調(diào)亡一種，自噬亦屬其中一種方式。凋亡可由細(xì)胞內(nèi)特殊基因程序啟動(dòng)而引起細(xì)胞死亡，多為自然發(fā)生，但也可由一些生理性或毒性因子誘發(fā)。自噬稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是真核細(xì)胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)。自噬在氨基酸和激素等因素的調(diào)控下對(duì)蛋白質(zhì)等大分子和細(xì)胞器進(jìn)行降解，降解產(chǎn)物可作為新合成蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的原料。目前認(rèn)為自噬與凋亡在宏觀與微觀的不同層次相互作用以有機(jī)地輔助機(jī)體完成生命活動(dòng)的精細(xì)調(diào)控。因此，自噬與凋亡之間可能存在網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)通路。某些情

5、況下，自噬可保護(hù)細(xì)胞免于凋亡和壞死的危險(xiǎn)。在各種因素(如氧化、TNF-α、FasL、鈣超載等)的刺激下，線粒體滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道開(kāi)放，線粒體腫脹，釋放cyc-c等凋亡因子。此時(shí)，細(xì)胞啟動(dòng)自噬來(lái)清除受損線粒體，避免凋亡因子釋放進(jìn)入胞漿，從而對(duì)細(xì)胞起到一定保護(hù)作用。 研究發(fā)現(xiàn)，在許多疾病中可見(jiàn)到凋亡與自噬并存的現(xiàn)象，如亨廷頓病、震顫性麻痹和精神分裂癥等。在形態(tài)學(xué)方面的研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，可見(jiàn)到細(xì)胞內(nèi)的自噬功能增強(qiáng)。在TG

6、F-1誘導(dǎo)的牛多核表皮細(xì)胞死亡中，凋亡和自噬典型形態(tài)學(xué)特征甚至出現(xiàn)于同一個(gè)細(xì)胞。這些研究均表明自噬與凋亡之間存在內(nèi)在聯(lián)系。 另外，由于PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)可出現(xiàn)于自噬通路中，卻又能被在凋亡中起重要執(zhí)行作用的caspase-3所降解，令我們對(duì)caspase-3在自噬中的作用倍感興趣。所以，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)caspase-3的變化，以進(jìn)一步了解其在自噬中的作用?？紤]到活化后的caspase-3常是凋亡終末期的標(biāo)志，我們希

7、望能檢測(cè)到更早時(shí)期的caspase-3變化，遂將caspase-3酶原作為檢測(cè)目標(biāo)。 所以，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察支氣管哮喘病人T淋巴細(xì)胞及其亞群的白噬現(xiàn)象以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)在T淋巴細(xì)胞及其亞群中存在的程序性細(xì)胞死亡方式，并對(duì)自噬與凋亡及caspase-3的關(guān)系進(jìn)行初步探討。且因目前尚無(wú)糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘病人T淋巴細(xì)胞自噬作用的報(bào)道，我們亦將對(duì)糖皮質(zhì)激素在哮喘T淋巴細(xì)胞亞群中的自噬作用進(jìn)行初步探討，為尋找新的治療措施提供方向。 第一部

8、分健康人T淋巴細(xì)胞及其亞群自噬誘導(dǎo)模型的建立。 一.方法 將經(jīng)密度梯度離心法、尼龍棉柱法和磁分離法分離所得的健康人T淋巴細(xì)胞及CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴細(xì)胞，分地塞米松(DXM)、長(zhǎng)春新堿(VCR)及空白(blank)組培養(yǎng)24<'->96h后觀察細(xì)胞光鏡及電鏡形態(tài)學(xué)、MDC熒光染色，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)自噬和凋亡細(xì)胞比例、caspase-3比例變化。 二．結(jié)果 1.健康人外周血T淋巴細(xì)胞在無(wú)誘導(dǎo)

9、劑條件下，或經(jīng)VCR誘導(dǎo)均可出現(xiàn)典型自噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 2.健康人外周血T淋巴細(xì)胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)的自噬率與凋亡率有顯著相關(guān)性，p=0.041。 3.健康人外周血CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴細(xì)胞自噬率與caspase-3比例無(wú)明顯相關(guān)性，p>0.05。 第二部分支氣管哮喘病人T淋巴細(xì)胞及其亞群自噬觀察。 一．方法 本實(shí)驗(yàn)部分通過(guò)磁分離法分離、培養(yǎng)哮喘病人T淋巴細(xì)胞及CD4<'+>、CD8<'

10、+>T淋巴細(xì)胞，檢測(cè)72 h不同藥物組的細(xì)胞自噬率、凋亡率和caspase-3比例變化。 二.結(jié)果 1.哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞自噬現(xiàn)象的觀察 ①哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞自然培養(yǎng)狀態(tài)下，與健康對(duì)照組比較，自噬率無(wú)明顯差異，p>0.05。 ②哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞經(jīng)DXM誘導(dǎo)，與健康對(duì)照組比較，自噬率明顯升高，p=0.035。 ③哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞經(jīng)VCR誘

11、導(dǎo)，與健康對(duì)照組比較，自噬率明顯升高，p=0.047。 2.哮喘病人CD8<'+>T淋巴細(xì)胞自噬現(xiàn)象的觀察哮喘病人CD8<'+>T淋巴細(xì)胞無(wú)論經(jīng)DXM、VCR或自然培養(yǎng)條件下，自噬率與健康對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異，p>0.05。 3.哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的觀察 ①哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞自然培養(yǎng)狀態(tài)下，與健康對(duì)照組比較，凋亡率明顯下降，p=0.023。 ②哮喘病人CD4<'+>T

12、淋巴細(xì)胞經(jīng)DXM誘導(dǎo)，與健康對(duì)照組比較，凋亡率明顯下降，p=0.005。 ③哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)，與健康對(duì)照組比較，凋亡率明顯下降，p=0.012。 4.哮喘CD4<'+>T淋巴細(xì)胞caspase-3比例變化的觀察 ①哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞自然培養(yǎng)狀態(tài)下，與健康對(duì)照組比較，caspase-3比例明顯下降，p=0.004。 ②哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞經(jīng)DXM誘導(dǎo)，與

13、健康對(duì)照組比較，caspase-3比例明顯下降，p=0.031。 ③哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)，與健康對(duì)照組比較，caspase-3比例無(wú)明顯變化，p>0.05。 5.哮喘病人CD8<'+>T淋巴細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的觀察 ①哮喘病人CD8<'+>T淋巴細(xì)胞自然培養(yǎng)狀態(tài)下，與健康對(duì)照組比較，凋亡率明顯升高，p=0.026。 ②哮喘病人CD8<'+>T淋巴細(xì)胞經(jīng)DxM誘導(dǎo)，與健康對(duì)照組比較，凋亡率

14、無(wú)明顯差異，p>0.05。 ⑧哮喘病人CD8<'+>T淋巴細(xì)胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)，與健康對(duì)照組比較，凋亡率無(wú)明顯差異，p>0.05。 6.哮喘病ACD8<'+>T淋巴細(xì)胞caspase-3比例變化的觀察哮喘病人cD8<'+>T淋巴細(xì)胞自然培養(yǎng)狀態(tài)下，或經(jīng)DXM、VCRi誘導(dǎo)，與健康對(duì)照組比較，其caspase-3 比例均無(wú)明顯差異，p>0.05。 7.哮喘病．kCD4<'+>T淋巴細(xì)胞自噬與凋亡現(xiàn)象的相關(guān)性分析

15、 ①哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞自噬率與凋亡率變化無(wú)明顯相關(guān)性，p>0.05。 ②哮喘病人CD4<'+>T淋巴細(xì)胞自噬率與caspase-3比例變化無(wú)明顯相關(guān)性，p>0.05。 8.哮喘病人CD8<'+>T淋巴細(xì)胞自噬與凋亡現(xiàn)象的相關(guān)性分析 ①哮喘病人ACD8<'+>T淋巴細(xì)胞自噬率與凋亡率變化無(wú)明顯相關(guān)性，p>0.05。 ②哮喘病人CD8<'+>T淋巴細(xì)胞自噬率與caspase-3比例變化無(wú)明顯相