四個H22克隆細(xì)胞株的RAPD特征及H22-H8D8傳代細(xì)胞的生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：可移植性腫瘤動物模型，可以客觀的模擬人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。因此，在人類腫瘤的發(fā)病機(jī)理和抗腫瘤藥物的篩選研究中被廣泛采用。由于腫瘤細(xì)胞株在長期的保存?zhèn)鞔^程中，受到各種不穩(wěn)定因素影響。例如細(xì)胞遺傳污染和基因變異等。故經(jīng)過一段時間之后，腫瘤細(xì)胞的遺傳物質(zhì)可能發(fā)生變異，并導(dǎo)致其生物學(xué)特性的改變，從而降低腫瘤動物模型的均一性和可比對性。因此要想保證腫瘤動物模型的穩(wěn)定性，必須對腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。 小鼠肝癌22(H22)是最

2、常用的小鼠可移植性腫瘤細(xì)胞系之一，廣泛應(yīng)用于小鼠腫瘤動物模型的復(fù)制。由于該細(xì)胞株建立己有五十多年歷史，許多學(xué)者報告它已發(fā)生較大遺傳變異，并且在不同研究機(jī)構(gòu)中所保存的細(xì)胞株亦有很大差異。劉軍須等對H22細(xì)胞株進(jìn)行了克隆化處理，得到經(jīng)篩選的4個克隆細(xì)胞株，分別為H22-H8D8、H22-H2C4、H22-H2G4、H22-H2E10，其中H22-H8D8克隆株基本符合H22原細(xì)胞系生物學(xué)特性，并具有性質(zhì)穩(wěn)定和表現(xiàn)均一的特點(diǎn)，已經(jīng)被中國典型培

3、養(yǎng)物保藏中心收藏。目前他們選用已知的單抗和核酸探針與H22-H8D8進(jìn)行反應(yīng)，初步建立腫瘤細(xì)胞株遺傳變異的檢查方法。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多分子生物學(xué)的方法已逐漸運(yùn)用到腫瘤細(xì)胞的遺傳檢測中。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)可適用于任何一種未知基因核苷酸序列的生物學(xué)研究，并且它能客觀地反映生物整個基因組的特征。近年來已有大量應(yīng)用RAPD技術(shù)研究物種遺傳多樣性的報道

4、，但運(yùn)用RAPD技術(shù)研究腫瘤細(xì)胞株遺傳特性的報道尚不多見。本研究擬從47條引物中篩選出能夠較好的區(qū)分4個H22克隆細(xì)胞株的特異性引物，以對4個H22克隆細(xì)胞株進(jìn)行RAPD特征分析研究。同時建立腫瘤動物模型，從體內(nèi)、體外兩方面觀察比較H22-H8D8傳代細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性。為進(jìn)一步比較分析其遺傳背景提供基礎(chǔ)資料。 方法：一、選用47條隨機(jī)引物對4個克隆細(xì)胞株(H22-H8D8、H22-H2C4、H22-H2G4、H22-H2E10)

5、進(jìn)行RAPD特征的分析研究。 1腫瘤細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)：從液氮罐中取出凍存管，迅速置于38℃水浴使其融化；無菌操作下取出細(xì)胞懸液至離心管中，補(bǔ)加10mlGKN液，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，去除上清液，重復(fù)一次該步驟。用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后移入培養(yǎng)瓶中，置于5℃CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液；按1∶2的比例傳代細(xì)胞，傳代間隔一般是1次/天。 2基因組DNA的制備：用傳代細(xì)胞系作供體細(xì)胞，集細(xì)胞總數(shù)在1×108個，用P

6、BS液洗滌及TE緩沖液重懸細(xì)胞，加入DNA裂解液，55℃過夜，Tris飽和酚及氯仿-異戊醇(24∶1)分別抽提，然后加入醋酸鈉及無水乙醇沉淀得到基因組DNA，75％的乙醇洗滌后，TE溶解備用。 3RAPD特征分析：應(yīng)用47條引物對4個H22細(xì)胞克隆株的基因組DNA進(jìn)行RAPD-PCR，反應(yīng)過程有40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性1分鐘，36℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘。于首次循環(huán)前94℃變性2分鐘，末次循環(huán)后72℃延伸10分鐘

7、。擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。 二、對H22-H8D8傳代細(xì)胞的RAPD特征分析以及腫瘤動物模型生物學(xué)特征研究。 1培養(yǎng)H22-H8D8細(xì)胞并傳代，提取其原代、25代、50代、75代、100代細(xì)胞的基因組DNA，運(yùn)用篩選出的3條引物(1222-101：AAGTCCGC、SBSAA-16：GGAACCCACA、SBSAC-05：GTTAGTGCGG)進(jìn)行RAPD-PCR分析。 2收集培養(yǎng)的H22-H8D8原代

8、、50代和100代細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用GKN調(diào)整濃度為2×106細(xì)胞/毫升，接種BALB/c小鼠右腋皮下，建立腫瘤動物模型，觀察各組小鼠腫瘤生長情況。 3H22-H8D8原代、50代和100代細(xì)胞，分別等量接種BALB/c小鼠腹腔，觀察各組荷瘤小鼠壽命。 4H22-H8D8原代、50代和100代細(xì)胞分別皮下接種BALB/c小鼠建立動物模型，經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)，觀察H22-H2D8傳代細(xì)胞腫瘤模型對CTX治療的敏感性。

9、 結(jié)果1本實(shí)驗(yàn)采用47條隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出明顯的條帶，條帶數(shù)以4～10條居多，片段大小在200～2000bp之間。從中篩選出3條引物(1222-101：AAGTCCGCTC、SBSAA-16：GGAACCCACA、SBSAC-05：GTTAGTGCGG)在四個克隆細(xì)胞株中具有很好得多態(tài)性。 2應(yīng)用上述3條引物對H22-H8D8原代、25代、50代、75代和100代的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，RAPD圖譜相互比較未發(fā)

10、現(xiàn)差異。 3H22-H8D8原代、50代和100代細(xì)胞株分別在BALB/c小鼠右腋皮下接種，均能生長瘤塊，于接種后第10天處死小鼠，取出瘤塊稱量，瘤重依次分別是1.9±0.46、2.0±0.33、1.9±0.38。作方差分析表明，兩兩比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4H22-H8D8原代、50代和100代細(xì)胞分別接種BALB/c小鼠腹腔，均能生長腹水和殺死小鼠，小鼠存活天數(shù)分別為13～20天、11～22天、14～

11、23天，存活天數(shù)均數(shù)比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 5H22-H8D8原代、50代和100代細(xì)胞分別皮下接種BALB/c小鼠建立動物模型，經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)，抑瘤率分別為41.2％、42％、41.7％，兩兩比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論14個H22克隆細(xì)胞株基因組之間存在差異，引物(1222-101：AAGTCCGCTC、SBSAA-16：GGAACCCACA、SBSAC-05：GTTAG

12、TGCGG)能夠區(qū)分4個克隆細(xì)胞株。 2本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H22-H8D8原代、25代、50代、75代、100代之間的RAPD條帶沒有差異，提示在體外培養(yǎng)條件下，H22-H8D8克隆細(xì)胞株傳代至100代時，應(yīng)用RAPD方法未發(fā)現(xiàn)遺傳變異。 3H22-H8D8不同代細(xì)胞分別接種BALB/c小鼠建立的動物模型，原代、50代和100代時腫瘤重量、荷瘤小鼠壽命以及對環(huán)磷酰胺治療的敏感性均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，結(jié)果與RAPD擴(kuò)增結(jié)果相一致