肺癌干細胞脊柱轉(zhuǎn)移裸鼠模型的建立及相關研究.pdf

1、研究目的：
　　 目前，隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，不可避免的的環(huán)境污染的加重；大量使用農(nóng)藥造成糧食、蔬菜、水果的污染以及食品添加劑的使用；醫(yī)療水平提高、經(jīng)濟條件的改善；平均壽命的延長；不良情緒和不良生活習慣等諸多因素使腫瘤發(fā)病率不斷升高，腫瘤已成為威脅人類健康的重要疾病。每年約有265萬人最后失去生命就是因為罹患腫瘤及腫瘤相關并發(fā)癥。近年來，國內(nèi)外醫(yī)學相關工作者越來越重視對腫瘤及其并發(fā)癥的的研究，同時對腫瘤的診斷、治療包括內(nèi)外科的治療

2、以及放化療等治療的結(jié)合取得了巨大的進步，肺癌、肝癌、乳腺癌包括一些原發(fā)性惡性腫瘤的生存期及預后還是較差，對腫瘤發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移等機制的認識不足是腫瘤治療預后不理想的主要原因，臨床上缺乏有效的治療手段。
　　 我國衛(wèi)生部屬下腫瘤防治辦公室曾做過這樣的統(tǒng)計：我國腫瘤發(fā)病率排序中，肺癌、乳腺癌分別位居男、女性惡性腫瘤發(fā)病首位，而肺癌則是所有惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤。有學者在臨床中發(fā)現(xiàn)，對死亡的肺癌患者進行尸檢，發(fā)現(xiàn)高達90％的肺癌死亡患

3、者已經(jīng)有脊柱轉(zhuǎn)移。肺癌以及肺癌脊柱轉(zhuǎn)移瘤惡性程度非常高，生長迅速，侵襲性非常強，發(fā)生脊柱轉(zhuǎn)移早，肺癌患者生存期預期差，生活質(zhì)量差，5年生存率低。國內(nèi)外對肺癌的治療是在外科治療的基礎上，結(jié)合化療、放療和免疫治療等措施，治療措施相對規(guī)范和統(tǒng)一。目前國內(nèi)外醫(yī)學界的一個挑戰(zhàn)性難題就是怎樣對肺癌轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤進行有效的治療，現(xiàn)在國內(nèi)外對肺癌轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤患者的治療理念已由消極的對癥處理向以外科治療為主，結(jié)合放療、化療等綜合治療為輔的積極治療措施轉(zhuǎn)

4、變，使患者的脊髓神經(jīng)功能得以改善，生活質(zhì)量有了顯著的提高。但仍很難阻止肺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲的機制目前很難解釋，而腫瘤干細胞理論的提出則為其提供了很好的解決思路。腫瘤干細胞理論認為僅有極少數(shù)腫瘤細胞(即腫瘤干細胞)而非全部腫瘤細胞具有致瘤性。腫瘤干細胞和正常干細胞一樣多處于靜止期，與大多數(shù)快速增殖的腫瘤細胞不同，常規(guī)放、化療都不易殺到它，即使殺死絕大多數(shù)腫瘤細胞，但只要有甚至只需要極少量的的腫瘤干細胞沒被殺死，腫瘤的復

5、發(fā)則肯定存在。這一理論很好地解釋了眾多骨腫瘤醫(yī)師對肺癌脊柱轉(zhuǎn)移長期療效較差的臨床困惑。
　　 本研究針對肺癌脊柱轉(zhuǎn)移特性，選取肺癌細胞株A549分離獲得腫瘤干細胞，并進行干細胞的鑒定，以此為基礎建立肺癌干細胞裸鼠脊柱轉(zhuǎn)移模型，為進一步研究肺癌脊柱轉(zhuǎn)移機制、早期診斷及靶向治療提供依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 選用肺癌細胞株A549，傳代培養(yǎng)采用添加生長因子的無血清培養(yǎng)技術誘導肺癌球體細胞；應用免疫熒光染色檢測腫瘤

6、球體細胞中蛋白Sox2，Nanog及Oct4的表達，誘導肺癌細胞球；利用流式細胞術檢測體細胞中CD133標志的表達；免疫磁珠法以CD133為標志分選腫瘤干細胞。最后將分選所得腫瘤干細胞制成細胞懸液，采用左心室注射法，從而建立基于干細胞理論的肺癌干細胞裸鼠脊柱轉(zhuǎn)移模型。
　　 結(jié)果：
　　 1、肺癌細胞在無血清培養(yǎng)基中生長，加入生長因子，成功誘導腫瘤細胞球體形成；
　　 2、應用細胞免疫熒光檢測肺癌球體細胞中Sox

7、2，Nanog及Oct4蛋白的表達，Sox2，Nanog及Oct4蛋白在多數(shù)細胞中陽性表達，流式細胞術檢測肺癌脊柱轉(zhuǎn)移瘤球體細胞中CD133的表達。
　　 3、細胞侵襲實驗、細胞增殖實驗及成瘤實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD133+細胞具有較強的侵襲性、增殖能力，能夠在小鼠體內(nèi)成瘤。
　　 4、免疫磁珠法以CD133為標志分選肺癌干細胞，經(jīng)左心室注射成功建立肺癌裸鼠脊柱轉(zhuǎn)移動物模型并對其進行相關研究。
　　 結(jié)論：
　　

8、 利用普通細胞株細胞，在無血清培養(yǎng)基中添加細胞生長因子EGF、TGF-β1、bFGF等能成功誘導肺癌細胞球體細胞，免疫熒光法檢測表明：Sox2，Nanog及Oct4蛋白在該細胞中多數(shù)細胞呈陽性表達；流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)：CD133可以作為肺癌干細胞重要的表面標志，基于以上原理，應用免疫磁珠法分選出其中的CD133+細胞，細胞侵襲實驗、細胞增殖實驗及成瘤實驗結(jié)果提示CD133+細胞具有很強的侵襲性、增殖能力，能夠在小鼠體內(nèi)成瘤。肺癌干細胞分