裸鼠皮下移植人神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型的建立和HIF-la及其相關(guān)蛋白的表達(dá).pdf

1、背景及目的：神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma，NB)是小兒最常見(jiàn)的惡性實(shí)體腫瘤之一，具有惡性程度高、侵襲力強(qiáng)，而且早期轉(zhuǎn)移率高、晚期病例多、治療效果差的特點(diǎn)。1999年小兒實(shí)體腫瘤協(xié)作組的統(tǒng)計(jì)資料顯示，神經(jīng)母細(xì)胞瘤大約占全部小兒惡性實(shí)體腫瘤病例的21.4％。在先天性畸形和感染性疾病診治水平已明顯提高的當(dāng)今社會(huì)，神經(jīng)母細(xì)胞瘤仍然是嚴(yán)重威脅兒童生命健康的一個(gè)常見(jiàn)死亡原因。所以，如何提高神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床研究和診治水平并探討研究腫瘤的

2、預(yù)后，仍然是國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題。建立可靠的動(dòng)物模型是研究成功的基石，目前常用的荷人神經(jīng)母細(xì)胞瘤動(dòng)物模型為裸小鼠的皮下移植瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位瘤。
　　 隨著腫瘤細(xì)胞的失控性增殖生長(zhǎng)，機(jī)體需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，導(dǎo)致大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣被消耗，形成一個(gè)缺氧環(huán)境，為克服缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和缺氧對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，腫瘤內(nèi)通過(guò)形成新生血管形促使腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)和增殖。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF

3、)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)低氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，可促進(jìn)有機(jī)體對(duì)低氧的適應(yīng)過(guò)程，是細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)缺氧變化最主要的調(diào)節(jié)因子，研究證實(shí)HIF是介導(dǎo)腫瘤缺氧適應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可在基因水平上直接調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glucosetransporter-1，GLUT-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(transforming g

4、rowth factor-α，TGF-α)等細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)利用人腎上腺神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株建立裸鼠皮下移植人神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型，并探討神經(jīng)母細(xì)胞瘤中HIF-1α、VEGF、TGF-α等的表達(dá)情況，了解他們?cè)谀[瘤與正常組織中表達(dá)的差異，旨在了解缺氧誘導(dǎo)因子及其相關(guān)蛋白在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用，探討其與腫瘤的臨床病理、預(yù)后的關(guān)系，為NB的發(fā)病機(jī)理研究和診治提供新的思路與方法。
　　

5、 方法：應(yīng)用KP-N-NS人腎上腺神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株建立裸小鼠皮下移植瘤模型40只，作為腫瘤組；陽(yáng)性對(duì)照組選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科2006年1月至2010年1月手術(shù)切除的神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤標(biāo)本；陰性對(duì)照組選取正常人腎上腺髓質(zhì)組織。采用Envision免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組組織中HIF-1α、VEGF及TGF-α的表達(dá)情況，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)合免疫組化結(jié)果將腫瘤組分為HIF-1α陽(yáng)性組與HIF-1α陰性組，對(duì)兩組的生

6、存情況(體重變化、瘤體重量、存活天數(shù))進(jìn)行比較，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果：4周后解剖結(jié)果證實(shí)成模率80％；HIF-1α及其相關(guān)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)均主要表現(xiàn)為細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒；腫瘤組、陽(yáng)性對(duì)照組與正常組HIF-1α、VEGF、TGF-α陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.70％±10.68％、69.80％±9.91％、71.43％±8.52％，70.35％±13.09％、67.45％±9.91％、70.30％±9.86％和

7、9.67％±4.53％、6.80％±3.40％、6.50％±4.44％，三種蛋白在腫瘤組織與正常組織中的表達(dá)差異具有顯著性(P<0.01)，腫瘤組與陽(yáng)性對(duì)照組HIF-1α、VEGF、TGF-α三種蛋白的IOD(陽(yáng)性染色的積分光密度)值分別為141.97±7.98、151.85±14.35、139.94±4.50，141.34±6.44、144.06±8.51、149.00±13.63，均明顯高于陰性對(duì)照組，p<0.01。HIF-1α在腫

8、瘤組與陽(yáng)性對(duì)照組中的表達(dá)與VEGF的表達(dá)成正相關(guān)(x2=7.778r=0.504 P<0.01)，HIF-1α在腫瘤組與陽(yáng)性對(duì)照組中的表達(dá)與TGF-α的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(x2=0.208 P=0.934 P>0.05)；HIF-1α陽(yáng)性組與HIF-1α陰性組體重變化、瘤體重量及存活天數(shù)比較t值分別為：-3.43、3.69、4.30，P值均小于0.01。通過(guò)分析腫瘤組40例裸鼠生存時(shí)間與HIF-1α表達(dá)水平的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，HIF-1α陰性組中

9、位生存時(shí)間為24天，最長(zhǎng)生存時(shí)間為33天；HIF-1α陽(yáng)性組中位生存時(shí)間為17天，最長(zhǎng)生存時(shí)間為22天；生存時(shí)間分別用LogRank，Breslow，Tarone-Ware檢驗(yàn)，P值均小于0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.該模型用于研究人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤，造模時(shí)間短，成瘤率高，生物學(xué)行為與人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤接近。
　　 2.HIF-1α、VEGF、TGF-α在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，在腫瘤組織的表達(dá)明顯高于正常組織。

10、
　　 3.HIF-1α與VEGF在腫瘤組織中的表達(dá)有明顯相關(guān)性，HIF-1α與TGF-α在腫瘤組織中的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性，HIF-1α與VEGF在腫瘤的血管浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起了重要作用。
　　 4.HIF-1α陽(yáng)性組小鼠較HIF-1α陰性組小鼠體重減輕明顯、瘤體體積大、存活天數(shù)短，說(shuō)明HIF-1α在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中陽(yáng)性表達(dá)率的高低對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的生存時(shí)間有明顯的影響，HIF-1α的高表達(dá)可以認(rèn)為是代表預(yù)后不良的一個(gè)重要