角膜環(huán)狀皮樣瘤致病基因PITX2 R62H突變體的功能研究.pdf

1、角膜環(huán)狀皮樣瘤是一種十分罕見的先天性良性腫瘤，呈常染色體顯性遺傳，雙眼發(fā)病，為環(huán)形淡黃色或灰白色的實性腫物，一般侵及角膜實質(zhì)淺層，多位于角膜緣處，可延伸到角膜和結(jié)膜，患者可出現(xiàn)視力的改變，如不規(guī)則散光、弱視和斜視。在組織學(xué)上腫塊由不同比例的外胚層包括角化的上皮、頭發(fā)、皮脂腺和中胚層包括纖維組織、脂肪組織、血管組成。2004年，中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點實驗室采用定位候選克隆策略從一個遺傳了四代共55人的角膜環(huán)狀皮樣瘤家系中克隆了該病的致

2、病基因PITX2。家系中的所有患者都攜帶PITX2基因的G185A突變，家系中以及無血緣關(guān)系的正常人都不帶有這種突變，證明在這個家系中PITX2G185A突變是造成角膜環(huán)狀皮樣瘤的原因。 PITX2是屬于Bicoid同型盒家族的轉(zhuǎn)錄因子，并且與另外兩種高度同源的轉(zhuǎn)錄因子PITX1和PITX3構(gòu)成PTX亞家族。PITX2是脊椎動物心臟和腸道系統(tǒng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，也是介導(dǎo)左右不對稱發(fā)育的信號分子，基因剔除小鼠模型顯示PITX2功能

3、的缺失會導(dǎo)致胚胎多器官多形態(tài)的異常，并且在胚胎期致死。PITX2的突變可以引發(fā)多種遺傳性疾病。 PITX2G185A突變導(dǎo)致編碼產(chǎn)物Arg62His(R62H)的改變。本文用overlapPCR的方法定點引入G185A突變到野生型PITX2cDNA中，并克隆到不同的真核表達載體。用PITX2-GFP融合載體瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察GFP綠色熒光來了解PITX2的定位，用PITX2-myc重組載體瞬時轉(zhuǎn)染HeLa

4、細胞和COS-7細胞，制備核蛋白進行WesternBlot分析，結(jié)果顯示R62H突變體表現(xiàn)出完全的細胞核定位，重組蛋白在不同的真核細胞中都能穩(wěn)定表達，并且大小沒有改變。用放射性同位素標(biāo)記的CE-3寡核苷酸探針與PITX2蛋白共孵育后進行電泳遷移率變動分析，R62H突變體能夠與標(biāo)記探針特異性結(jié)合，并且結(jié)合能力與野生型沒有差異。構(gòu)建CE3-pGL3-promoter熒光素酶報告載體，與PITX2-myc共轉(zhuǎn)HeLa細胞，熒光素酶活性分析顯示

5、R62H突變體的轉(zhuǎn)錄激活能力有小幅降低。用流式細胞儀分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PITX2的HeLa單克隆的細胞周期，R62H突變體延緩細胞進入S期，但是促進細胞從S期→G2/M期的轉(zhuǎn)換。我們推測R62H轉(zhuǎn)錄激活能力的降低是造成細胞周期改變和角膜環(huán)狀皮樣瘤的原因。 本文還引入了另外兩種導(dǎo)致遺傳病的PITX2突變，即與AxenfeldRieger綜合征相關(guān)的T68P和與虹膜發(fā)育不良相關(guān)的R84W，對這兩種突變體功能分析的結(jié)果與其他研究者的報道一致