hERG基因Q738X突變體的功能檢測(cè).pdf

1、先天性長(zhǎng)QT綜合征(long QT syndrome,LQTS)是由于編碼心肌細(xì)胞離子通道的基因發(fā)生突變而引起的。目前已發(fā)現(xiàn)13個(gè)與LQTS相關(guān)的致病基因。我國(guó)LQTS患者主要是LQT2。LQT2是因Herg基因發(fā)生突變所致。Berg基因編碼快速激活延遲整流鉀通道(rapid activating delay rectifier K+channel,Ikr),Ikr是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極期的主要離子通道。最近報(bào)道臨床上檢測(cè)到了Herg基

2、因的一個(gè)新的突變位點(diǎn)Q738X,并且本課題組已經(jīng)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)及激光共聚焦技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行了鑒定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單獨(dú)轉(zhuǎn)染Q738X-Herg的HEK-293細(xì)胞中記錄不到電流,而Q738X-Herg與WT-Herg按1:1轉(zhuǎn)染時(shí)可以記錄到Berg鉀電流,但電流幅度比單獨(dú)轉(zhuǎn)染相同量WT-Herg的HEK-293細(xì)胞降低了一半。通過(guò)激光共聚焦技術(shù)表明Q73gX-Herg的蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。得出結(jié)論:Q738X-Herg對(duì)WT-Herg

3、無(wú)顯性負(fù)效應(yīng),可能是轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷導(dǎo)致了LQTS。因此本實(shí)驗(yàn)要明確突變體Q738X導(dǎo)致LQTS的具體機(jī)制是否與蛋白的組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒包括:①野生型WT-Herg;②突變型Q738X-Herg;③對(duì)照組未轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞。同時(shí)利用蛋白印跡分析(Western blot),觀察突變體Q738X蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)情況。
　　 另外,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Flag-WT-Her

4、g和Myc-Q738X-Herg載體,然后利用免疫共沉淀檢測(cè)野生型與部分突變型亞單位是否能構(gòu)成四聚體。
　　 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染Q738X的細(xì)胞中只觀察到未成熟Herg蛋白,而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T的細(xì)胞可觀察到成熟和未成熟兩種Herg蛋白形式。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Q738X的亞基和野生型Herg的亞基不能結(jié)合形成四聚體結(jié)構(gòu)。說(shuō)明Q738X的突變影響B(tài)erg蛋白的組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)功能,使到達(dá)細(xì)胞膜表面有功能的Berg蛋白數(shù)