一種通過(guò)GFP結(jié)合蛋白強(qiáng)化GFP三分子熒光互補(bǔ)作用方法的建立與驗(yàn)證.pdf

1、目的:
　　將改造后的GFP（super-fold GFP，簡(jiǎn)寫為sfGFP）作為三分子熒光互補(bǔ)方法的基礎(chǔ)，通過(guò)應(yīng)用多種GFP結(jié)合蛋白，觀察其對(duì)熒光互補(bǔ)的影響，篩選并驗(yàn)證可強(qiáng)化熒光互補(bǔ)作用的GFP結(jié)合蛋白，優(yōu)化GFP三分子熒光互補(bǔ)技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用。
　　方法:
　　1.綠色熒光蛋白篩選:細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，選取野生型GFP(EGFP)與結(jié)構(gòu)改造后的superfolderGFP(sfGFP)相比下，熒光強(qiáng)度

2、的差異。
　　2.構(gòu)建我們自己的三分子熒光互補(bǔ)技術(shù)體系:將sfGFP拆分為三部分（GFP1-9，GFP10和GFP11），建立GFP三分子熒光互補(bǔ)作用的實(shí)驗(yàn)體系。
　　3.GFP結(jié)合蛋白的篩選:利用多種GFP結(jié)合蛋白在細(xì)胞水平對(duì)GFP三分子熒光互補(bǔ)作用進(jìn)行檢驗(yàn)，篩選出可強(qiáng)化熒光互補(bǔ)作用的GFP結(jié)合蛋白;通過(guò)GFP結(jié)合蛋白與重組裝的GFP共定位，探索GFP結(jié)合蛋白是否可以結(jié)合到三拆分后重新組裝的GFP上去;再通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;最后通過(guò)GFP結(jié)合蛋白與GFP的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GFP結(jié)合蛋白與GFP的結(jié)合位點(diǎn)。
　　4.共聚焦研究GFP重組裝的定位能力:以LNMB1為研究對(duì)象使用共聚焦顯微鏡研究重新組裝的綠色熒光是否與具有特征性定位的蛋白位置相同。
　　5.GFP三分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的衍生:將三分子互補(bǔ)技術(shù)拓展到五分子互補(bǔ)，并進(jìn)行檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1:通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)得出sfGFP比野生型EGFP具有更強(qiáng)的熒光，推斷sfG

4、FP更加適合用于研究。
　　2.成功構(gòu)建GFP三分子熒光互補(bǔ)技術(shù)體系，三拆分后的GFP可以通過(guò)相互作用的蛋白牽引，重新組裝得到綠色熒光。
　　3.發(fā)現(xiàn)了三種GFP結(jié)合蛋白，DARPin-GFP、GFP-enhancer和NbsfGFP能夠在細(xì)胞中對(duì)三拆分后的GFP重組起到2-4倍的加強(qiáng)效果;GFP結(jié)合蛋白與GFP可共定位，推論出，是GFP結(jié)合蛋白的直接結(jié)合導(dǎo)致GFP熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而排出其它增強(qiáng)因素;體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果;而且也揭示了GFP結(jié)合蛋白與GFP結(jié)合部位與GFP10-11這段結(jié)構(gòu)有緊密聯(lián)系。
　　4.激光共聚焦觀察，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)重新組裝的GFP定位到具有特征性的核膜(LNMB1)上，猜測(cè)，也許是實(shí)驗(yàn)細(xì)胞選取或者是融合蛋白的順序影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　5.GFP三分子熒光互補(bǔ)衍生成5個(gè)分子，無(wú)熒光，或許是蛋白較多，空間位阻效應(yīng)較嚴(yán)重，阻礙了GFP重新結(jié)合成完整的熒光分子。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)熒光對(duì)比，我們鎖定了熒光強(qiáng)