EGA-GFP和CD-GFP對纖維素纖維的作用機理及應(yīng)用研究.pdf

1、纖維素酶是將纖維素協(xié)同催化降解生成葡萄糖的多種糖苷水解酶的總稱。纖維素酶作為一種高效生物制劑，順應(yīng)了人們對清潔生產(chǎn)加工和可持續(xù)發(fā)展的要求，具有廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)已成為世界第三大工業(yè)用酶。然而，纖維素酶在紡織染整加工過程中的存在織物強度損傷大、酶成本高和過程可控性差等問題，至今尚無完善的解決方案。目前，纖維素酶對天然纖維素纖維改性的研究大多是基于混合酶和復(fù)配酶展開的生產(chǎn)過程優(yōu)化和參數(shù)調(diào)整，對纖維素酶的催化水解機理、不同纖維素酶分子的協(xié)同作

2、用、同一纖維素酶分子中各活性結(jié)構(gòu)域的功能仍不是十分清楚，對這些深層次問題的認識不足導(dǎo)致纖維素酶在紡織染整領(lǐng)域應(yīng)用的可控性受到一定的限制。
　　纖維素酶的研究開發(fā)多集中于木霉屬和曲霉屬來源的纖維素酶，而鮮見動物內(nèi)源性纖維素酶及其結(jié)構(gòu)域的催化水解機理和應(yīng)用等研究工作的開展。本文通過基因克隆的方法構(gòu)建新的重組綠色熒光福壽螺內(nèi)源性內(nèi)切纖維素酶EGA及其催化結(jié)構(gòu)域CD質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達，鎳柱親和純化獲得高比活力的重組酶，探索纖維素酶在結(jié)

3、合結(jié)構(gòu)域 CBD缺失的情況下對底物選擇性及棉纖維作用后纖維形態(tài)、光致發(fā)光性、表面基團、結(jié)晶度和織物強度等性能的影響，該結(jié)果對動物內(nèi)源性纖維素酶及其結(jié)構(gòu)域的酶學(xué)理論基礎(chǔ)和相關(guān)應(yīng)用技術(shù)的研究具有重要的理論意義和實踐指導(dǎo)價值。本課題的研究工作和結(jié)果主要在以下幾個方面：
　　1.利用基因工程方法構(gòu)建含綠色熒光蛋白的EGA-GFP、CD-GFP重組表達載體。在大腸桿菌中表達重組綠色熒光蛋白，其最佳表達條件為：EGA-GFP和CD-GFP的最

4、適反應(yīng)溫度分別為16℃和20℃；誘導(dǎo)劑IPTG最佳終濃度為0.1mM，誘導(dǎo)時間20 h以上能夠獲得最佳酶比活力和產(chǎn)量。鎳柱親和純化獲得的重組纖維素酶的熒光光譜相同，最大激發(fā)波長為390 nm，最大發(fā)射波長在508 nm，發(fā)射光譜位于可見光綠色光區(qū)。重組綠色熒光纖維素酶EGA-GFP和其催化結(jié)構(gòu)域CD-GFP的最適pH值和pH值穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度和穩(wěn)定穩(wěn)定性與前期實驗獲得EGA和CD基本性質(zhì)相似，略有差別，其原因可能是GFP的插入，使得

5、酶分子的拓撲微結(jié)構(gòu)變化而致。
　　2.采用SDS-PAGE法研究重組纖維素酶EGA、結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBD和催化結(jié)構(gòu)域CD對底物的選擇性。研究結(jié)果表明：三種重組蛋白能夠吸附到不同類型的纖維素底物上，但對不同底物的吸附結(jié)合能力有所差別。CD能夠弱吸附到三種不同類型的纖維素，對底物不存在選擇性；CBD和EGA對底物的選擇性吸附一致，微晶纖維素Avice上吸附量均為最小。通過激光共聚焦法研究重組綠色熒光纖維素酶EGA-GFP和CD-GFP對棉

6、纖維的吸附情況。結(jié)果表明：重組綠色纖維素酶EGA-GFP和催化結(jié)構(gòu)域CD-GFP均能快速聚集到棉纖維表面形成綠色熒光薄層使纖維表面熒光強度逐漸增大。相同情況下，EGA-GFP吸附到棉纖維表面的熒光強度顯著高于CD-GFP，且吸附速率快，說明結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在有利于酶分子更快更強地吸附到棉纖維表面，軟件分析結(jié)果表明上述兩者吸附到棉纖維表面的酶濃度約有2倍之差。
　　3.重組纖維素酶EGA-GFP和催化結(jié)構(gòu)域CD-GFP在對棉織物(纖維

7、)處理過程中都產(chǎn)生減重率、形態(tài)結(jié)構(gòu)、纖維表面基團、纖維聚合度和織物拉伸性能等變化。纖維素酶EGA-GFP分子中結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在，導(dǎo)致完整纖維素酶作用棉纖維過程中存在不完全可逆催化構(gòu)象變化，纖維素酶 EGA-GFP分子不能全部脫離底物結(jié)合點而重新尋找新的結(jié)合位點，使得部分酶分子只能固定于某一位點深度催化酶解，以致纖維素表面形成裂縫和洞穴，最終導(dǎo)致棉織物強力損失嚴重。催化結(jié)構(gòu)域CD-GFP中CBD的缺失，使酶分子與底物的吸附不牢固，進而使催

8、化結(jié)構(gòu)域催化水解位點隨機均勻地遍布纖維全表面，對纖維作用效果快，且強度損傷相對較小?；谏鲜霈F(xiàn)象，構(gòu)建含 CBD結(jié)構(gòu)域的纖維素酶分子和缺失CBD結(jié)構(gòu)域的活性催化結(jié)構(gòu)域的兩種重組酶催化水解棉纖維過程模型，揭示兩者作用方式的差異性。
　　4.纖維素酶與載體采用戊二醛交聯(lián)固定化后，纖維素酶的儲存穩(wěn)定性有很大提高，可多次重復(fù)使用，相同的纖維素酶和不同載體交聯(lián)方式不同，得到的固定化酶的性能也不同。苧麻織物經(jīng)纖維素酶處理后，纖維表面的粗糙度、