β-Arrestin對血管收縮功能及缺血性腦卒中的影響.pdf

1、[目的]:
　　 本課題利用基因敲除小鼠研究β-Arrestin在血管和大腦中的作用。課題分為三個部分:第一部分是β-Arrestin的表達以及基因敲除小鼠的鑒定;第二部分是β-Arrestin對小鼠血管收縮功能的影響;第三部分是β-Arrestin對小鼠缺血性腦卒中的影響。
　　 [方法]:
　　 第一部分:β-Arrestin的表達以及基因敲除小鼠的鑒定。按要求分別將引入的β-Arrestin1和β-Arre

2、stin2雜合子種鼠分別交配后大量繁殖。待幼鼠4周大時，β-Arrestin1小鼠提取尾巴DNA、測定DNA濃度后做real time-PCR鑒定基因型;β-Arrestin2小鼠的尾巴DNA直接做PCR鑒定基因型。取8-12周大的C57BL6小鼠以及不同基因型小鼠麻醉處死后，迅速取胸主動脈、心臟和大腦，組織經(jīng)過勻漿、蛋白濃度測定，然后做Western blot，分析β-Arrestin1和β-Arrestin2蛋白在上述三種組織的表達

3、情況。
　　 第二部分:β-Arrestin對小鼠血管收縮功能的影響。該部分主要研究β-Arrestin1或β-Arrestin2敲除小鼠的胸主動脈收縮舒張功能的改變。取8-12周大的不同基因型（野生型、雜合子和純合子）敲除小鼠，脫臼處死后取胸主動脈，迅速去掉血管外膜和內(nèi)皮，每條胸主動脈可切成2條5mm的血管環(huán)，在離體血管灌流系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)定后，分別給予新福林(Phe)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的刺激，考察其收縮反應。
　　

4、第三部分:β-Arrestin對小鼠缺血性腦卒中的影響。該部分主要研究分別敲除兩種β-Arrestin對小鼠大腦永久缺血后的影響。取8-12周大的三種基因型（野生型、雜合子和純合子）敲除小鼠和C57BL6小鼠做大腦中動脈栓塞(MCAO)手術;基因敲除小鼠24小時后進行神經(jīng)學評分;評分后麻醉小鼠，將大腦切片后用2％TTC染色，拍照后計算大腦梗死體積（缺血區(qū)面積與全腦面積百分比）;C57BL6小鼠24h后取缺血區(qū)半暗帶和對側腦組織，West

5、em blot檢測β-Arrestin1和β-Arrestin2表達量的改變。原代培養(yǎng)敲除小鼠（純合子和野生型）神經(jīng)元，糖氧剝奪實驗(OGD)處理后檢測細胞存活率、細胞活性及細胞毒性。明確β-Arrestin1和β-Arrestin2是否對缺血性腦卒中產(chǎn)生影響。
　　 [結果]:
　　 第一部分:1.β-Arrestin1在小鼠大腦、心臟和胸主動脈表達較為豐富，β-Arrestin2在大腦和心臟有表達，而在胸主動脈表達較

6、低。
　　 第二部分:1.小鼠胸主動脈環(huán)最適靜息張力為1.5g;2.β-Arrestin1和β-Arrestin2敲除小鼠胸主動脈環(huán)對AngⅡ反應性較低，且與野生型的反應性無差別;3.β-Arrestin1雜合子小鼠胸主動脈環(huán)對Phe張力略高于野生型，無統(tǒng)計學差異;β-Arrestin2純合子小鼠胸主動脈環(huán)對Phe張力與野生型沒有差異。
　　 第三部分:1.成年C57BL6小鼠永久性MCAO后24h時，β-Arresti

7、n1和β-Arrestin2在缺血區(qū)半暗帶蛋白表達上調(diào)，β-Arrestin1上調(diào)程度更明顯;2.敲除β-Arrestin1，MCAO后24小時雜合子小鼠和野生型小鼠的大腦梗死體積相近、神經(jīng)功能評分一致，而純合子小鼠大腦梗死體積變大、神經(jīng)學評分增加，術后24小時死亡率增加;3.敲除β-Arrestin2，MCAO后24小時雜合子小鼠和野生型小鼠大腦梗死體積相近，但比野生型小鼠大腦梗死體積減少，純合子神經(jīng)功能評分稍低但與野生型組沒有統(tǒng)計學

8、差異，術后死亡率不變。4.敲除β-Arrestin1，OGD處理2h引起的神經(jīng)元死亡細胞數(shù)增多，細胞活力降低，釋放LDH增加。
　　 [結論]:
　　 1.敲除β-Arrestin不影響小鼠胸主動脈對Phe誘導的收縮反應。
　　 2.小鼠胸主動脈對血管緊張素Ⅱ誘導的收縮反應很低，該現(xiàn)象與β-Arrestin無關。
　　 3.β-Arrestin1對缺血性腦卒中具有保護作用，是一種內(nèi)源性保護因子。