胰島素保護缺血-再灌注心肌的抗炎機制-Akt-eNOS的關(guān)鍵作用.pdf

1、研究背景與實驗?zāi)康模?br>　　近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，胰島素除用于控制血糖，還可用于治療嚴重?zé)齻?、膿毒血癥、感染性休克等危重疾病，改善病人癥狀，降低病人死亡率，但其作用機制并不清楚。進一步研究發(fā)現(xiàn)，胰島素可減輕燒傷或膿毒血癥大鼠系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)。對于急性心肌梗死（AMI）患者，靜脈注射胰島素可降低血漿中C反應(yīng)蛋白（CRP）和血清淀粉樣蛋白A（SAA）的水平。這些結(jié)果均提示胰島素具有顯著的抗炎作用。
　　另一方面，炎癥反應(yīng)是造成心肌缺

2、血／再灌注（MI/R）損傷的重要機制之一。腫瘤壞死因子（TNF）-α是在MI/R早期產(chǎn)生的一種重要的促炎細胞因子，它不僅能夠誘導(dǎo)其他炎性細胞因子的增加，而且還可促進細胞粘附分子的表達，進一步引起中性粒細胞在心肌組織的浸潤以及心臟功能的衰竭。大量臨床試驗表明AMI、膿毒血癥及心衰等疾病中TNF-α的增加均可導(dǎo)致心肌細胞死亡和功能異常。聯(lián)系以上兩個方面我們思考：胰島素治療是否能抑制炎性細胞因子如TNF-α的生成，減輕MI/R病理過程中的炎癥

3、反應(yīng)？如果是，胰島素抗炎作用的具體機制是什么？
　　我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，胰島素可通過PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活心肌內(nèi)源性eNOS-NO系統(tǒng)。已知NO具有一定的抗炎特性，在多種生理病理狀態(tài)下可幫助調(diào)節(jié)組織器官的血流并保持血管內(nèi)皮細胞和炎癥細胞的協(xié)調(diào)性。越來越多的臨床試驗提示eNOS-NO信號系統(tǒng)在AMI及其他炎癥相關(guān)疾病的病理過程中具有重要作用。但是，胰島素是否通過誘導(dǎo)心肌內(nèi)源性NO生成在MI/R病理過程中發(fā)揮抗炎作用，尚需進

4、一步深入研究。因此，本研究的實驗?zāi)康氖牵?br>　　1．明確胰島素治療能否抑制炎性細胞因子（尤其是TNF-α）的產(chǎn)生，減輕MI/R病理損傷過程中的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用。
　　2．如果是，進一步探討胰島素抗炎作用的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，尤其是Akt、eNOS等信號分子在其中的作用。
　　3．研究胰島素的上述抗炎效應(yīng)是否最終有助于保護缺血心肌。
　　實驗方法：
　　1．整體動物實驗：Sprague-Dawley雄性

5、大鼠，常規(guī)制備大鼠急性MI/R（30min/3h）模型。將動物隨機分為四組，每組8只。①假手術(shù)組（ShamMI/R）：開胸，但不結(jié)扎冠狀動脈；②生理鹽水組（MI/R＋V）；③葡萄糖-胰島素-鉀（GIK）組（MI/R＋GIK）：250g/L葡萄糖＋60U/L胰島素＋80mmol/LKCl；④GK組（MI/R＋GK）：250g/L葡萄糖＋80mmol/LKCl。上述液體分別以4ml/kg/h速度于再灌注前5min開始輸注并持續(xù)到再灌注結(jié)束。

6、
　　2．再灌注3h結(jié)束后，利用血糖儀檢測血糖變化，放免法測定血漿胰島素水平。采用伊文氏蘭－TTC雙染法測定心肌梗死面積，以梗死面積（INF）占缺血區(qū)面積（AAR）的百分比表示（INF/AAR×100％）。
　　3．再灌注結(jié)束后處死動物，收集血液，分離血清，分光光度法檢測血清肌酸激酶（CK）活性，利用ELISA試劑盒檢測血清TNF-α和IL-10的含量；同時留取心肌組織，分光光度法檢測心肌髓過氧化物酶（MPO）活性，ELIS

7、A試劑盒檢測心肌TNF-α的含量。
　　4．離體實驗：原代分離培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，給予模擬缺血/再灌注（SI/R，2h/4h）處理，再灌注時隨機分為以下幾組（n=8）：①Vehicle（無酚紅DMEM）；②胰島素（10-7mol/L）;③胰島素＋PI3K特異性抑制劑wortmannin（10nmol/L）；④胰島素＋eNOS抑制劑L-NAME（100μmol/L）；⑤中和性抗TNF-α抗體（Neutralizinganti-TNF-

8、αIgG）或者NonimmuneIgG（5μg/ml）；⑥胰島素＋中和性抗TNF-α抗體（5μg/ml）。
　　5．再灌注結(jié)束后，臺盼藍染色檢測心肌細胞活性，AnnexinV/PI雙染經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡率，WesternBlot測定心肌細胞Akt、eNOS表達和磷酸化水平的變化。同時收集細胞培養(yǎng)上清，利用ELISA試劑盒測定TNF-α含量，特異性NO檢測試劑盒測定NOX含量。
　　1．與生理鹽水組相比，GK組大鼠血糖顯

9、著升高（P<0.01），GIK組血糖無明顯變化；與生理鹽水組相比，GIK（P<0.01）和GK（P<0.05）組血漿胰島素水平均升高（n=8）。
　　2．心肌缺血30min再灌注3h導(dǎo)致大鼠血清促炎細胞因子TNF-α和抗炎細胞因子IL-10水平明顯升高（與假手術(shù)組相比，P均<0.01，n=8）。與生理鹽水組相比，再灌注時給予GIK顯著降低血清TNF-α水平，同時促進IL-10水平進一步升高；而GK組與生理鹽水組相比無明顯差別，提示

10、胰島素可減輕MI/R大鼠系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)。
　　3．與假手術(shù)組相比，缺血30min再灌注3h導(dǎo)致心肌組織中TNF-α生成大量增加、MPO活性（反映中性粒細胞的浸潤水平）顯著升高。與生理鹽水組相比，再灌注時給予GIK而非GK顯著減少心肌TNF-α生成（19.73±1.45pg/mgprotein,與生理鹽水組28.31±2.31pg/mgprotein相比，P<0.01，n=8），進而降低心肌MPO活性（與生理鹽水組相比，P<0.0

11、1，n=8）。這些結(jié)果提示再灌注時給予胰島素可抑制中性粒細胞在缺血／再灌注心肌的浸潤，減輕心肌組織局部的炎癥反應(yīng)。
　　4．與假手術(shù)組相比，MI/R大鼠心肌梗死面積和血清CK活性均明顯增加。再灌注時給予GIK顯著降低心肌梗死面積（37.6±2.2％，與生理鹽水組49.5±2.8％相比，P<0.05，n=8）和血清CK活性（P<0.01，n=8）；而僅給予GK則對大鼠心肌梗死面積和血清CK活性均無明顯影響，提示再灌注時給予胰島素可明

12、顯減輕缺血／再灌注心肌損傷。
　　5．與正常培養(yǎng)狀態(tài)相比，缺血2h再灌注4h導(dǎo)致心肌細胞TNF-α生成大量增加。再灌注時給予胰島素可顯著降低TNF-α生成（9.04±1.01pg/106cells，與Vehicle組16.31±1.44pg/106cells相比，P<0.01,n=8），同時使心肌細胞Akt和eNOS的磷酸化水平分別升高2.6倍和2.1倍、NO生成明顯增加（P<0.01）；胰島素的上述作用可被wortmannin或

13、L-NAME阻斷。這些結(jié)果提示胰島素可通過激活PI3K-Akt-eNOS信號通路，促進NO生成，進而抑制缺血／再灌注心肌細胞TNF-α產(chǎn)生。
　　6．缺血2h再灌注4h導(dǎo)致心肌細胞存活率降低，凋亡率增加。再灌注時給予胰島素或中和性抗TNF-α抗體均能顯著提高心肌細胞存活率（分別為76.6±2.1％、67.5±2.4％，與Vehicle組相比，P均<0.01，n=8），降低細胞凋亡率（分別為20.5±1.2％、28.0±1.3％，與

14、Vehicle組相比，P均<0.01，n=3）；與單獨胰島素作用相比，中和性抗TNF-α抗體與胰島素的聯(lián)合應(yīng)用并不能進一步地改變心肌細胞的存活率和凋亡率（P均>0.05）。這些結(jié)果表明胰島素可通過抑制TNF-α生成，促進心肌細胞存活、抑制心肌細胞凋亡，保護缺血心肌。
　　結(jié)論：
　　胰島素可通過激活PI3K-Akt-eNOS-NO信號通路，減少缺血／再灌注心肌TNF-α生成，抑制心肌中性粒細胞的浸潤，減輕心肌損傷，保護缺血心