丹參山楂組分配伍抗動脈粥樣硬化及作用機制研究.pdf

1、心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是世界上發(fā)病率和病死率較高的疾病之一。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是導致CVD的重要病理基礎。一些中藥在臨床防治AS上有較好的療效，但是中藥研究存在的一些問題阻礙了對其的深入研究:1）中藥在臨床多以飲片形式入藥，眾多的影響因素使飲片的質量不易控制;2）現代藥效評價模型不能很好地與中醫(yī)的“證”相對應;3）中藥多成分、多靶點的特點較難體現等。隨著分析儀

2、器的不斷更新，其他學科理論和技術的引入，目前對上述研究中存在的問題，已經有了一些解決對策和實踐:1）制備成分相對穩(wěn)定的中藥有效組分進行配伍，探討組分配伍替代飲片配伍的可行性;2）生物體內源性成分（小分子代謝物）在生理、病理及中藥治療狀態(tài)下，表達譜的改變可能反映了中醫(yī)證候規(guī)律的物質基礎在代謝物水平上的變化，因此以體內代謝物為研究對象的代謝組學，為從系統(tǒng)生物學的角度詮釋中藥的整體作用提供了研究思路;3）基于生物調控網絡角度的網絡藥理學方法，

3、可用于分析中藥多種活性成分所發(fā)揮的綜合或整合調節(jié)作用，為解析中藥多靶點、多途徑的作用機制及配伍規(guī)律提供了新的方法。
　　 丹參山楂是中醫(yī)治療CVD的常用藥對之一，臨床和動物實驗研究表明二者配伍在防治AS上具有較好的療效。為了更好的闡釋丹參山楂配伍的內涵和作用機制，本研究擬從丹參山楂組分配伍入手，建立AS大鼠模型，在此基礎上，采用多藥效指標綜合評價和代謝組學相結合的方法，篩選丹參山楂抗AS的有效組分;進而采用正交設計優(yōu)化抗AS組分

4、的配伍;另一方面，對有效組分進行化學成分定性定量分析，以網絡藥理學預測作用機制;進而考察較優(yōu)配伍抗AS的作用機制。
　　 1.組分的制備及其化學成分分析
　　 制備丹參山楂單煎及合煎的不同組分:丹參總糖組分(DST)、丹參總酚酸組分(DSF)、丹參脂溶性組分(DSZ);山楂糖組分(SZT)、山楂黃酮組分(SZH)、山楂脂溶性組分(SZZ);合煎糖組分(HJT)、合煎水溶性組分(HJS)、合煎脂溶性組分(HJZ)。采用HP

5、LC法對各組分中的化學成分進行定性定量分析，檢出丹參素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、蘆丁/金絲桃苷、異槲皮素、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、齊墩果酸/熊果酸等成分。定量分析結果顯示SZH中原花青素B2、表兒茶素、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素含量分別為4.84％、4.00％、0.23％、0.28％、0.14％;DSF中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A含量分別為3.50％、1.67％、64.78

6、％、0.96％; HJS中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、原花青素B2、表兒茶素的含量分別為1.93％、2.35％、0.47％、39.52％、1.74％、1.05％;DSZ中隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量分別為3.40％、5.31％;HJZ中隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量分別為3.01％、4.54％。
　　 2.抗AS有效組分的篩選
　　 2.1各組分對AS大鼠影響的考察
　　 采用高脂飼養(yǎng)、腹腔注射維生素D3及卵

7、清白蛋白誘發(fā)炎癥的復合方法建立AS大鼠模型。以辛伐他汀為陽性對照，從降脂活性(total cholesterol，TC;triglyceride，TG;high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C; low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、抗氧化活性(malondialdehyde，MDA;superoxide dismutase，SOD)、內皮保護

8、活性(nitric oxide，NO; endothelin，ET;6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α;thromboxane B2，TXB2)、抗炎活性(C-reactive protein，CRP; interleukin8，IL-8; interleukin18，IL-18; interleukin1β，IL-1β)上考察各組分的抗AS作用（口服灌胃給藥4周），同時進行病理形態(tài)學觀察;采用主

9、成分分析(principal component analysis，PCA)和聚類分析進行綜合評價，篩選有效組分;析因分析觀察丹參山楂的交互作用。結果顯示，不同組分干預后的抗AS作用不同，其中DSF降低了AS大鼠血中TC、TG、LDL-C、ET、TXB2、CRP、IL-18、IL-1β水平(P＜0.05)，升高了SOD、6-keto-PGF1α水平(P＜0.05);SZH降低了TC、TG、LDL-C、ET、TXB2、CRP、IL-8、I

10、L-18、IL-1β水平(P＜0.05)，升高了HDL-C、SOD、6-keto-PGF1α水平(P＜0.05);DSZ降低了TC、TG、LDL-C、ET、IL-1β水平，升高了6-keto-PGF1α、HDL-C、NO水平(P＜0.05); SZZ降低了TC、LDL-C、ET水平(P＜0.05);SZT降低了IL-18水平(P＜0.05)。PCA結果表明DSZ-1、DSF-4、SZH-1的綜合效應較好，聚類分析與PCA的趨勢一致。病理

11、結果顯示DSZ-1、SZH-1、HJS-1、SZT-4的主動脈病變較模型組明顯減輕，DSZ-1、HJS-4、SZT-4組顯著抑制了主動脈內膜變厚(P＜0.05);析因分析結果顯示DSF與SZH在降脂、內皮保護、抗炎活性上存在交互作用。綜上，DSF、SZH、DSZ為丹參山楂抗AS的有效組分。
　　 2.2有效組分的代謝組學評價
　　 采用三甲基硅烷化衍生的方法，建立AS大鼠血清代謝物的GC/MS分析方法，采用PCA和偏最小

12、二乘法-判別分析(partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA)觀察代謝物輪廓變化，篩選生物標志物，觀察有效組分的干預作用。PLS-DA結果表明，模型組與正常組可明顯地聚為兩類，與正常組比較，模型組大鼠血清乳酸、纈氨酸、甘油、異亮氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、核糖、酪氨酸、十七酸、肌醇、亞油酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸水平顯著降低(P＜0.05)，賴氨酸和油酸水平顯著升高(P＜0.0

13、5)，表明這15個成分是差異代謝物。進一步的分析表明，AS大鼠在脂肪酸代謝、氨基酸代謝和糖代謝通路上發(fā)生紊亂。不同有效組分在一定程度上可逆轉這種紊亂，其中SZH顯著升高了乳酸、甘油、異亮氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、核糖、酪氨酸、花生四烯酸、肌醇和亞油酸水平(P＜0.05或P＜0.01);DSF顯著升高了乳酸、甘油、苯丙氨酸、異亮氨酸水平(P＜0.05或P＜0.01)，降低賴氨酸水平(P＜0.01)，且呈量效關系;HJS可顯著升高乳酸、甘油

14、、異亮氨酸水平(P＜0.01)，降低賴氨酸水平(P＜0.01);DSZ可升高乳酸、甘油、異亮氨酸、酪氨酸水平(P＜0.05或P＜0.01)。與合煎相比，單味藥對代謝輪廓的回調作用較優(yōu)，提示丹參山楂合用比例和劑量需要優(yōu)化。
　　 3.抗AS有效組分配伍的研究
　　 在AS大鼠模型上，采用正交設計(L934)的方法，對DSF、SZH、DSZ高(1)、中(2)、低(3)3個劑量水平的不同配比進行實驗，采用多藥效指標觀察其抗AS

15、作用;以多因素方差分析、PCA和聚類分析對實驗數據進行綜合評價。結果表明，各配伍組具一定的降脂、抗氧化、內皮保護和抗炎活性;多因素方差分析結果顯示DSF(2)-SZH(2)-DSZ(1)為側重降脂的較優(yōu)配比，DSF(3)-SZH(2)-DSZ(1)為側重抗氧化的較優(yōu)配比，DSF(3)-SZH(3)-DSZ(3)為側重內皮保護的較優(yōu)配比，DSF(3)-SZH(1)-DSZ(1)為側重抗炎較優(yōu)配比;PCA和聚類分析綜合評價結果顯示DSF(2

16、)-SZH(1)-DSZ(2)(SC121)為抗AS的較優(yōu)配伍;病理結果顯示SC121可顯著抑制主動脈斑塊進展，同時減輕肝臟的脂肪變性和炎性浸潤。
　　 4.網絡藥理學預測有效組分的作用機制
　　 采用系統(tǒng)藥理學軟件TCMSP(http://tcmspnw.com/default)，對SZH中5個主要成分進行口服利用度和類藥性預測，提取主要成分的作用靶標，通過搜索PharmGKb、TTD和DrugBank數據庫，確定了與

17、CVD密切相關的靶標20個，這些靶標涉及花生四烯酸代謝、精氨酸/一氧化氮、過氧化物增殖物受體和血小板聚集等通路。結合文獻報道的有關丹參網絡藥理學的分析，推測上述有效組分配伍的主要作用靶位為內皮細胞、炎性細胞及血小板等，介質為脂質，此預測結果與整體動物實驗結果相似。
　　 5.較優(yōu)配伍方的作用機制研究
　　 采用體外Ox-LDL和H2O2誘導人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical veinendothelia

18、l cells，HUVEC)損傷模型評價SC121的保護作用，實驗結果表明，SC121可提高HUVEC細胞存活率(P＜0.05或P＜0.01)，并呈一定的劑量依賴性。
　　 采用Ox-LDL和H2O2誘導巨噬細胞RAW264.7損傷模型評價SC121的保護作用;采用熒光素法測定SC121對RAW264.7細胞內活性氧的影響;采用油紅O染色法評價SC121對RAW264.7泡沫化形成的影響。結果顯示，SC121可提高RAW264.

19、7細胞存活率(P＜0.05或P＜0.01)，及抑制細胞內活性氧的產生和泡沫化的形成，并呈一定的劑量依賴性。
　　 綜上所述，本論文以AS大鼠模型為基礎，從丹參山楂組分配伍入手，通過多藥效指標綜合評價和代謝組學相結合的方法，篩選出了丹參山楂抗AS的有效組分(DSF、SZH、DSZ)，對其化學成分進行了定性定量分析;通過正交設計實驗確定了較優(yōu)配伍SC121;以網絡藥理學預測了有效組分的作用靶位為內皮細胞和炎性細胞等。體外結果表明，S