弓形蟲(chóng)緩殖子期特異性抗原SAG2C的基因克隆、蛋白表達(dá)及重組抗原的初步應(yīng)用.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞原蟲(chóng)，能感染幾乎所有的恒溫動(dòng)物(包括人類(lèi))，引起人獸共患的弓形蟲(chóng)病，估計(jì)全世界成年人中至少有1/3的人感染。弓形蟲(chóng)作為一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，在免疫功能正常的宿主體內(nèi)通常形成包囊，造成隱性感染；而當(dāng)機(jī)體免疫功能下降或受抑制(如惡性腫瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)時(shí)，處于隱性感染狀態(tài)的蟲(chóng)體就會(huì)活化，迅速增生繁殖，破壞宿主細(xì)胞而引起多器官的損害，嚴(yán)重者可導(dǎo)致宿主死亡

2、。婦女在妊娠早期感染弓形蟲(chóng)可引起流產(chǎn)、畸胎、死胎，或引起胎兒先天性弓形蟲(chóng)病，表現(xiàn)為智力低下、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、癲癇等，這些癥狀可在胎兒出生時(shí)或是成長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)。因此，弓形蟲(chóng)病的診斷和疫苗研制對(duì)于保護(hù)易感人群以及促進(jìn)人類(lèi)優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。 弓形蟲(chóng)感染的特點(diǎn)是機(jī)會(huì)性致病，其生物學(xué)基礎(chǔ)是速殖子和緩殖子的相互轉(zhuǎn)換，目前對(duì)弓形蟲(chóng)病的治療仍以藥物為主，對(duì)速殖子的殺滅作用較明顯，對(duì)包囊內(nèi)的緩殖子幾乎沒(méi)有作用。因此，弄清楚相互轉(zhuǎn)換的機(jī)制對(duì)于控

3、制弓形蟲(chóng)病有重要意義。速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)換的過(guò)程是各種因素綜合作用的過(guò)程，其中，不同期特異性抗原分子的差異性表達(dá)起了重要作用，因此克隆期特異抗原基因即為研究轉(zhuǎn)換機(jī)制創(chuàng)造條件。由于速殖子容易獲得，便于對(duì)其進(jìn)行研究，許多弓形蟲(chóng)基因已從速殖子中克隆、鑒定，其中大多數(shù)基因編碼的蛋白為速殖子與緩殖子共有的，只有少數(shù)幾個(gè)被證實(shí)為速殖子期特有的，近年來(lái)，由于速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)換機(jī)制引起研究者重視，一些緩殖子及包囊特有的蛋白的基因也已被克隆、鑒定。

4、 本研究嘗試克隆緩殖子期特異性抗原SAG2C基因，并在大腸桿菌中表達(dá)成熟的SAG2C蛋白片段(切除了N末端的信號(hào)肽和C末端的疏水尾)以及對(duì)重組抗原的免疫反應(yīng)性進(jìn)行分析；進(jìn)一步優(yōu)化蛋白的表達(dá)條件，純化表達(dá)蛋白以獲得大量高純度的重組蛋白，為進(jìn)一步的研究創(chuàng)造了條件，并且探討了重組抗原作為新型診斷抗原的可能性，為弓形蟲(chóng)緩殖子的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。 目的： 1.克隆弓形蟲(chóng)緩殖子期特異抗原SAG2C基因并在大腸桿菌中表達(dá)SA

5、G2C蛋白的成熟片段，分析重組表達(dá)抗原的免疫反應(yīng)性； 2.純化表達(dá)蛋白，獲取大量高純度的重組抗原，探討重組抗原在弓形蟲(chóng)病診斷上的應(yīng)用。 方法： 1.采取經(jīng)口感染的方法，用弓形蟲(chóng)Prugniaud株包囊感染昆明小鼠，采用RT—PCR從感染小鼠腦組織中擴(kuò)增SAG2C基因片段； 2.利用酶切、連接反應(yīng)構(gòu)建pMD19—T—SAG2C重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序分析； 3.采用PCR從構(gòu)建好的pMD19—T—SAG

6、2C中獲取截短的SAG2C基因片段，用限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切后插入以同樣酶切的質(zhì)粒pET32a(+)中，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a(+)—tSAG2C，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定； 4.將重組質(zhì)粒pET32a(+)—tSAG2C分別轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)； 5.優(yōu)化工程菌pET32a(+)—tSAG2C/BL21的表達(dá)條件，大量誘導(dǎo)表達(dá)后對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化； 6.Westernblot與E

7、LISA分析重組表達(dá)蛋白的免疫反應(yīng)性； 7.通過(guò)ELISA試驗(yàn)，用重組抗原對(duì)小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)； 8.通過(guò)ELISA試驗(yàn)，用重組抗原對(duì)人血清進(jìn)行檢測(cè)； 結(jié)果： 1.克隆了弓形蟲(chóng)緩殖子期特異抗原SAG2C的編碼基因與截短形式的SAG2C基因； 2.成功構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒pMD19—T—SAG2C與表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a(+)—tSAG2C，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)得到以可溶性形式表達(dá)的重組SAG2C，West

8、ernblot分析顯示重組SAG2C具有特異的免疫反應(yīng)性； 3.用重組SAG2C檢測(cè)11份弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠血清中IgG抗體，結(jié)果顯示11份血清檢測(cè)均為陽(yáng)性； 4.用重組SAG2C檢測(cè)285份人血清中弓形蟲(chóng)IgG抗體，結(jié)果顯示其陽(yáng)性率與對(duì)照的重組SAG1及BAG1檢測(cè)的陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異，但三者吻合度不高，可能是由于病人處于不同的感染時(shí)期； 結(jié)論： 1.首次從弓形蟲(chóng)Prugniaud株中，克隆出緩殖子期特