亞急性1,2-DCE中毒性腦水腫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、前言
　　二氯乙烷(Dichloroethane，DCE)系鹵代烴類(lèi)化合物，為工業(yè)上常用的有機(jī)溶劑之一，主要用于粘合劑、溶劑和氯代烴的生產(chǎn)。DCE有二種異構(gòu)體，其中1，2-DCE屬高毒類(lèi)，職業(yè)中毒均為1，2-DCE引起。1990年以前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)1，2-DCE職業(yè)中毒的報(bào)道很少。但1990年以后，國(guó)內(nèi)的多個(gè)省份陸續(xù)發(fā)生了多起嚴(yán)重的亞急性1,2-DCE職業(yè)中毒事故，其臨床表現(xiàn)以中毒性腦病為主，腦水腫為其主要的病理過(guò)程。目前，亞急性1

2、，2-DCE職業(yè)中毒已成為嚴(yán)重危害我國(guó)勞動(dòng)者健康與生命的職業(yè)病之一。但有關(guān)1，2-DCE中毒性腦水腫機(jī)制的研究資料很少，亟待進(jìn)行深入研究。
　　關(guān)于腦水腫的形成機(jī)制有眾多學(xué)說(shuō)，傳統(tǒng)的腦水腫發(fā)生機(jī)制學(xué)說(shuō)包括“血腦屏障損傷”、“能量代謝障礙”、“氧自由基損傷”、“鈣離子超載”及“神經(jīng)遞質(zhì)興奮性毒性損傷”等。其中，血腦屏障損傷和能量代謝障礙學(xué)說(shuō)被認(rèn)為是血管源性腦水腫和細(xì)胞毒性腦水腫發(fā)生的基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著人們對(duì)腦水腫機(jī)制研究的不斷深入，

3、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)和水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)表達(dá)異常在血管源性和細(xì)胞毒性腦水腫形成和發(fā)展過(guò)程中的作用受到了廣泛的關(guān)注。
　　本研究以昆明種小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)建立亞急性1，2-DCE中毒性腦水腫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，深入探討AQPs和MMPs表達(dá)、腦組織能量代謝及血腦屏障功能等在亞急性1，2-DCE中毒性腦水腫發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的改變，為揭示亞急性1，2-DCE中

4、毒性腦水腫的可能發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。
　　方法
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與染毒
　　實(shí)驗(yàn)一，腦水腫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立:選用雌性健康昆明種小鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組及1.1、1.2和1.3mg/L1，2-DCE染毒組，每組10只小鼠。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于100L靜式染毒柜中，每天染毒3.5h。染毒結(jié)束后的次日觀察小鼠中毒癥狀和死亡情況，若某組小鼠的死亡達(dá)半數(shù)以上，則終止整個(gè)實(shí)驗(yàn)，并處死各組剩余的存活小鼠。對(duì)照組小鼠除不暴露1

5、，2-DCE外，其余處理過(guò)程同染毒組小鼠。
　　實(shí)驗(yàn)二，腦水腫發(fā)生機(jī)制的研究:選用雌性健康昆明種小鼠200只，隨機(jī)分為對(duì)照組及1.2mg/L1，2-DCE染毒1d、2d和3d組，每組50只小鼠。將小鼠置于100L靜式染毒柜中，染毒組小鼠以1.2mg/L1，2-DCE每天染毒3.5h。對(duì)照組小鼠除不暴露1，2-DCE外，其余處理過(guò)程同染毒組小鼠。
　　2、指標(biāo)測(cè)定
　　染毒結(jié)束后，乙醚麻醉，斷頭處死小鼠，快速取腦組織進(jìn)行

6、如下檢測(cè)。
　　2.1腦含水量測(cè)定
　　腦含水量(％)=（濕重-干重）/濕重×100％。
　　2.2腦組織病理學(xué)觀察
　　取一側(cè)腦組織，甲醛固定72h后，普通石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，常規(guī)HE染色，普通光鏡下觀察。
　　2.3腦組織中AQP4、MMP2和MMP9表達(dá)的測(cè)定
　　采用RealtimeRT-PCR、Western-blot和免疫熒光組織化學(xué)法分別檢測(cè)小鼠腦組織中AQP4、MMP2

7、和MMP9蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　2.4腦組織能量代謝相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定
　　采用生化試劑盒法分別檢測(cè)小鼠腦組織中ATP和乳酸含量及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。
　　2.5血腦屏障超微結(jié)構(gòu)觀察
　　取另一側(cè)腦組織，低溫快速切取約1mm3腦皮質(zhì)，用2.5％戊二醛磷酸鹽緩沖液4℃下固定24h，1％鋨酸固定2h，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，采用透射電子顯微

8、鏡進(jìn)行腦皮質(zhì)中血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的觀察。
　　2.6腦組織中ZO-1和Occludin表達(dá)的測(cè)定
　　采用RealtimeRT-PCR、Western-blot和免疫熒光組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠腦組織中ZO-1和Occludin蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　3、統(tǒng)計(jì)分析
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)(SNK)。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果
　　一、亞急性1，2-DCE中毒性腦水腫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立
　　1、各組小鼠1，2-DCE中毒的表現(xiàn)
　　染毒3天后，1.2和1.3mg/L染毒組的存活小鼠除出現(xiàn)程度不同的行動(dòng)遲緩和軀體震顫外，在被抓尾提起時(shí)，小鼠表現(xiàn)有明顯的雙前肢交叉及雙后肢緊抱現(xiàn)象。除外，1.3mg/L染毒組共有6只小鼠死亡，1.2mg/L染毒組共有3只小鼠死亡。1.1mg/L染毒組無(wú)小鼠死亡，但1只小鼠有輕微中毒

10、表現(xiàn)。
　　2、1,2-DCE染毒對(duì)各組小鼠體重增長(zhǎng)的影響
　　1.3mg/L染毒組小鼠的體重隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加呈下降趨勢(shì)。1.2mg/L染毒組小鼠的體重在染毒1d時(shí)上升，隨后也呈下降趨勢(shì)，對(duì)照組和1.1mg/L染毒組小鼠的體重均呈緩慢上升趨勢(shì)。
　　3、1，2-DCE染毒對(duì)各組小鼠腦含水量和腦臟器系數(shù)的影響
　　1.2和1.3mg/L染毒組小鼠的腦含水量和腦臟器系數(shù)均顯著高于對(duì)照組。但1.1mg/L染毒組小鼠的

11、腦含水量和腦臟器系數(shù)與對(duì)照組比較均未見(jiàn)顯著差異。
　　4、1，2-DCE染毒對(duì)小鼠腦組織結(jié)構(gòu)影響的病理學(xué)觀察
　　對(duì)照組小鼠的腦組織結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)異常改變。而1.2和1.3mg/L染毒組小鼠的腦組織中，細(xì)胞核周?chē)幌对鰧挘麧{淡染，胞體腫脹變性，邊緣模糊;部分細(xì)胞及毛細(xì)血管周?chē)幌稊U(kuò)張等，呈現(xiàn)典型的腦水腫病理改變。1.1mg/L染毒組小鼠的腦組織結(jié)構(gòu)中未見(jiàn)明顯腦水腫病理改變。
　　二、亞急性1，2-DCE中毒性腦水腫發(fā)

12、生機(jī)制的研究
　　1、1，2-DCE染毒對(duì)各組小鼠腦組織中AQP4、MMP2和MMP9表達(dá)的影響
　　染毒2d和3d組的小鼠腦組織中AQP4蛋白含量及MMP9mRNA含量顯著高于對(duì)照組，而染毒3d組的小鼠腦組織中MMP2和MMP9蛋白含量及AQP4mRNA含量也顯著高于對(duì)照組;但各染毒組小鼠的腦組織中MMP2mRNA含量與對(duì)照組小鼠比較未見(jiàn)明顯改變。染毒1d組的小鼠腦組織中AQP4、MMP2和MMP9表達(dá)與對(duì)照組比較均未見(jiàn)顯

13、著差異。
　　2、1,2-DCE染毒對(duì)小鼠腦組織中能量代謝的影響
　　染毒3d組的小鼠腦組織中ATP含量顯著低于對(duì)照組，而染毒3d組的小鼠腦組織中乳酸含量顯著高于對(duì)照組。
　　各染毒組小鼠的腦組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性與對(duì)照組相比均呈下降趨勢(shì)，其中染毒2d和3d組的小鼠腦組織中Ca2+-ATPase活性均顯著低于對(duì)照組。染毒3d組的小鼠腦組織中Na+-K+-ATPase活性也顯著低于對(duì)照組。<

14、br>　　3、1,2-DCE染毒對(duì)小鼠的血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響
　　對(duì)照組小鼠的腦組織毛細(xì)血管管腔形態(tài)規(guī)則、內(nèi)皮細(xì)胞厚度適中，內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)清晰，基底膜厚薄均一，基底膜外有星形膠質(zhì)細(xì)胞終足圍繞;染毒1d組的小鼠腦組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞厚薄不等，但緊密連接結(jié)構(gòu)尚完整;染毒2d組的小鼠腦組織毛細(xì)血管管腔狹窄、閉塞，內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接松散。染毒3d組的小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接出現(xiàn)大量溶解、脫落，基底膜片狀溶解、缺失，星形

15、膠質(zhì)細(xì)胞終足極度水腫，呈現(xiàn)為大片電子空白區(qū)。
　　4、1，2-DCE染毒對(duì)小鼠腦組織中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的影響
　　各染毒組小鼠的腦組織中ZO-1和Occludin蛋白含量與對(duì)照組相比均呈下降趨勢(shì)，其中染毒2d和3d組的小鼠腦組織中ZO-1和Occludin蛋白含量顯著低于對(duì)照組小鼠。
　　各染毒組小鼠的腦組織中ZO-1和OccludinmRNA水平與對(duì)照組相比也呈下降趨勢(shì)，其中染毒2d和3d組的小鼠腦組織