兔左心室動脈灌流楔形標本在藥物潛在致心律失常風險評價中的應用.pdf

1、自上世紀50年代發(fā)現抗心律失常藥奎尼丁能引起心臟復極化延遲,引發(fā)嚴重室性心律失常即尖端扭轉性室性心動過速(torsade de pointes,TdP)以來,臨床越來越多的發(fā)現藥物引發(fā)TdP造成心源性暈厥、甚至猝死的報道。業(yè)已發(fā)現,能夠引發(fā)TdP的藥物涉及各個系統(tǒng)治療藥物,除延遲復極的抗心律失常藥外,常見藥物包括抗組胺藥、抗精神失常藥、抗菌藥、抗腫瘤藥及心血管系統(tǒng)藥物等。這些藥物盡管結構各異,但共同的作用是抑制心肌細胞復極化中起關鍵作用

2、的一種延遲整流鉀通道(該通道的孔區(qū)由human ether-a-go-go related gene編碼,簡稱HERG通道),延長心臟復極過程,心電圖上表現QT間期的延長。QT間期延長致復極離散度增大,大大增加心臟發(fā)生室性心動過速的危險。特非那定、阿司咪唑、西沙必利、米貝拉地爾及格帕沙星等藥因引發(fā)TdP被相繼撤出市場。基于藥物此種潛在致命性威脅的認識,人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會(ICH)于2002年11月專門發(fā)布了“人用藥品延遲心室

3、復極化(QT間期延長)潛在致心律失常作用的非臨床安全評價”指導原則的討論稿,經廣泛征求意見后于2005年5月形成了最后稿,作為國際新藥安全藥理研究的補充指導原則(S7B)于2005年12月正式啟用。
　　 S7B指導原則要求對QT間期延長藥物的非臨床安全性評價包括以下4個不同功能水平的研究:1)采用離體動物或人體心臟細胞、培養(yǎng)心臟細胞系或克隆人離子通道的異種表達體系評價對HERG離子流的影響。2)在離體心臟標本進行動作電位參數測

4、定,或在麻醉動物中進行能體現動作電位周期的特異性電生理參數檢測。3)測定清醒或麻醉動物的ECG參數。4)在離體心臟標本或動物進行致心律失常作用測定。其中前三項包括HERG電流、動作電位復極參數以及整體動物心電圖QT間期的評價均為通過延遲復極指標或參數間接判斷藥物引發(fā)心律失常的潛在危險。然而,由于藥物延遲復極程度與致心律失常危險性高低之間的關系尚未確立,近幾年,建立離體或整體敏感心律失常動物模型成為研究熱點。因藥物誘發(fā)TdP常常是在病理情

5、況下,特別是心肌復極儲備降低的心臟(如遺傳性LQTs、心肌肥厚或心衰等),常規(guī)正常動物心臟模型難以觀察到QT延長藥物的致心律失常作用,有研究顯示甲氧胺敏化兔模型以及慢性房室阻斷犬模型可提高評價的敏感性,此外,已報道的心律失常動物模型有離體動脈灌流左室楔形標本及Langendorff灌流兔心。在上述報道的四種模型中,動脈灌流左心室楔形標本具有較高的敏感性和特異性,而被越來越多地采用,該模型還對于理解心電圖復極波的細胞基礎及心律失常發(fā)生機制

6、具有重要幫助。
　　 目前,我國對藥物致心律失常危險性的認識處于起步階段,尚未建立完善的的技術評價體系,尤其是缺乏敏感心律失常模型。
　　 本實驗擬建立冠狀動脈灌流兔左心室楔形組織模型,即制作兔左心室游離壁楔形標本,經冠狀動脈左回旋支灌流臺式液,采用浮置玻璃微電極同步記錄心內膜、心外膜下心肌細胞動作電位及跨室壁心電圖,并利用此方法評價阿霉素的急性心臟毒性。該心律失常模型的建立將作為“QT延遲藥物潛在致心律失常危險性”評價

7、技術體系的一部分,用于新藥,特別是創(chuàng)新藥物非臨床安全性評價?？稍谛滤幯邪l(fā)過程中及早發(fā)現新藥潛在的致命性不良反應,從而做到合理評估藥物的研發(fā)前景,對降低創(chuàng)新藥物研發(fā)風險及預測藥物嚴重不良反應、保障人民生命安全均具有十分重要的意義。
　　 一、兔左心室動脈灌流楔形模型的建立
　　 目的:建立穩(wěn)定、敏感的兔左心室動脈灌流楔形組織模型
　　 方法:3～4個月齡新西蘭雌性白兔,體重2.0～2.5kg,耳緣靜脈注射肝素(20

8、0 IU/kg)抗凝、戊巴比妥鈉(30～35 mg/kg)麻醉后,迅速開胸取出心臟。先以低溫停跳液(KCl為24mmol/L、不含Ca2+的臺氏液)從主動脈逆行灌流,將自制灌流針經主動脈左竇開口處插入冠狀動脈左側回旋支,制成以回旋支為中心軸,長約10～20 mm、寬約5～10 mm、厚約3～3.5 mm的心室肌楔型組織塊。將組織塊固定于恒溫浴槽中,持續(xù)灌流充以純氧的正常臺氏液,溫度35.7±0.1℃,灌流速度為3～4ml/min。臺式液

9、組成(mmol/L):NaCl140、KCl5.4、MgCl21.0、CaCl22.0、HEPS10、葡萄糖10(pH7.35～7.45)。
　　 微電極拉制器制備記錄玻璃微電極,使其內充3 mol/L KCI時的電極電阻為10～20MΩ。玻璃微電極與懸浮鉑金絲電極相連,經微電極放大器、多道生理信號采集系統(tǒng)進行信號轉化、記錄。以1～2mm的間隔從外膜向內膜側心肌的動作電位(APD)進行記錄,觀察跨壁各層的動作電位時程特點,以確定

10、內、外膜下心肌記錄部位。
　　 將兩根玻璃微電極扎入同一平面內、外膜心肌細胞,同時在相同平面距離心室組織塊內、外膜側距離分別約為1.0～1.5 cm處放置電極記錄楔狀組織塊跨壁心電圖(ECG)。獲得穩(wěn)定的內、外膜側心肌細胞APD、跨壁ECG同步記錄。為驗證系統(tǒng)敏感性,分別記錄延長復極但不引發(fā)TdP的胺碘酮(100μmol/L,)、延長復極且引發(fā)TdP的莫西沙星(100μmol/L)給藥前及給藥后30min1Hz頻率刺激下APD、

11、ECG。計算以下參數:APD90(動作電位復極90％需要時間)、跨壁復極離散度(TDR)=內膜下細胞APD90-外膜下細胞APD90、QT間期(為QRS復合波的起點到T波降支終點之間的時程)、Tp-e間期(為T波的峰值與T波終點之間的時程,一般認為該時程間接反映跨壁TDR)。同時觀察藥物是否引發(fā)早后除極(EAD)。
　　 結果:(1)在動脈灌流組織塊標本上,從心外膜側到內膜側心肌細胞APD呈逐漸延長趨勢,除在兩例標本的中間層細胞

12、上偶記錄到平臺期明顯較內、外膜層長的APD外,未發(fā)現明顯的M細胞層。故心內、外膜細胞APD同步記錄時選擇內、外各約1/3側肌層細胞。(2)取得心內、外膜細胞APD、跨壁ECG同步記錄后,分別在0min、30min、60min、90min、120min給予1Hz刺激,APD90、QT間期在2h內無明顯改變,表明獲得了穩(wěn)定的組織塊灌流標本。(3)標本穩(wěn)定1～1.5小時后,灌流液中分別加入胺碘酮(100μmol/L)、莫西沙星(100μmol

13、/L)。結果顯示胺碘酮延長外膜層心肌APD90(由藥前的277±12延長至365±16,p＜0.05),同時亦延長內膜層心肌APDgo(由藥前的329±22延長至406±19,p＜0.05),但由于外膜的延長幅度大于內膜,TDR明顯減小(由對照的52±13減小到40±11,p＜0.05),QT間期明顯延長(由藥前的395±14延長至460±17,p＜0.05),Tp-e間期明顯減小(由對照的67±12減小到53±14,p＜0.05)。所

14、有記錄標本上均未發(fā)現EAD。莫西沙星可顯著延長外膜層心肌APD90(由藥前的287±17延長至335±21,p＜0.05),同時亦延長內膜層心肌APD90(由藥前的335±13延長至529±18,p＜0.05),其中內膜延長幅度遠大于外膜的延長幅度,TDR明顯增大(由對照的48±10增大到195±33,p＜0.05),QT間期顯著延長(由藥前的365±20延長至547±23,p＜0.05),Tp-e間期顯著增大(由對照的62±14增加到

15、22±23,p＜0.05),在六例標本中有四例出現EAD。
　　 結論:本實驗建立了穩(wěn)定的兔左心室動脈灌流楔形組織模型,此模型可同步記錄心內、外膜下心肌細胞動作電位及跨壁組織塊心電圖。利用延長復極但不引發(fā)TdP的胺碘酮和延長復極且引發(fā)TdP的莫西沙星驗證了系統(tǒng)各電生理指標的敏感性。該模型可用于QT延遲藥物潛在致心律失常危險性的評價。
　　 二、利用兔左心室動脈灌流楔形模型評價阿霉素的急性心臟毒性
　　 目的:評價

16、阿霉素急性應用的潛在致心律失常危險性
　　 方法:參照第一部分實驗方法制備穩(wěn)定的兔左心室動脈灌流楔形組織標本,分別在1Hz、0.5Hz刺激頻率下,記錄阿霉素(100μmol/L)給藥前及給藥后20min、40min、60min APD及ECG。計算以下參數:APD90(動作電位復極90％需要時間)、跨壁復極離散度(TDR)=內膜下細胞APD90-外膜下細胞APD90、QT間期(為QRS復合波的起點到T波降支終點之間的時程)、Tp

17、-e間期(為T波的峰值與T波終點之間的時程,一般認為該時程間接反映跨壁TDR),同時觀察藥物是否引發(fā)早后除極(EAD)。
　　 結果:取得心內、外膜細胞APD、跨壁ECG同步記錄后,灌流液中加入阿霉素,在1Hz和0.5Hz頻率刺激下,灌流前和灌流20min、40min、60min后相比較,左心室壁內、外膜動作電位時程(APD)、TDR、QT間期、Tp-e間期均無顯著性差異(P＞0.05)。結果顯示,在1Hz刺激頻率下,阿霉素在一

18、小時內對外膜層心肌APD90無明顯作用(給藥前后變化分別為362±12、366±25、365±23、361±13,P＞0.05),對心內膜亦無明顯作用(給藥前后變化分別為402±22、405±27、405±17、398±21,P＞0.05),TDR無明顯變化(給藥前后分別為42±9、40±12、41±11、38±16,P＞0.05),QT間期無明顯變化(給藥前后分別為419±25、416±22、420±12、418±13,P＞0.05)

19、,Tp-e間期無明顯變化(給藥前后分別為61±13、60±10、63±15、60±11,P＞0.05)。在0.5Hz刺激頻率下,阿霉素在一小時內對外膜層心肌APD90亦無明顯作用(給藥前后變化分別為360±16、364±13、365±11、361±20,P＞0.05),對心內膜亦無明顯作用(給藥前后變化分別為401±11、405±17、407±12、397±24,P＞0.05),TDR無明顯變化(給藥前后分別為41±15、40±10、4