縮短QT間期藥物潛在致心律失常風(fēng)險(xiǎn)及其標(biāo)志物的研究.pdf

1、QT間期是指QRS波群起點(diǎn)至T波終點(diǎn)的時(shí)間間隔，代表心室除極開(kāi)始至心室復(fù)極結(jié)束的時(shí)間間期，心室肌細(xì)胞膜上各種離子通道有序的開(kāi)放和關(guān)閉是心臟正常電活動(dòng)的基礎(chǔ)，動(dòng)作電位形狀、時(shí)程取決于去極化和復(fù)極化離子流之間相互的精細(xì)平衡，Na+、Ca2+內(nèi)流使細(xì)胞膜去極化，各種外向K+電流使動(dòng)作電位復(fù)極化，心室K+電流主要包括瞬時(shí)外向K+電流Ito、ATP敏感鉀電流IKATP,延遲整流K+電流及內(nèi)向整流K+電流IK1，延遲整流K+電流區(qū)分為快、慢兩種成分

2、IKr和IKs。先天遺傳基因改變或后天獲得性因素引起心肌離子通道結(jié)構(gòu)和/或功能紊亂，打破動(dòng)作電位各種離子流之間的精細(xì)平衡，從而引起心肌復(fù)極延遲或加速，導(dǎo)致QT間期的延長(zhǎng)或縮短是誘發(fā)心律失常產(chǎn)生的重要原因。
　　自上世紀(jì)發(fā)現(xiàn)抗心律失常藥奎尼丁能引起心臟復(fù)極化延遲，引發(fā)嚴(yán)重室性心律失常即尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過(guò)速（torsade de pointes,TdP）以來(lái)，臨床發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的藥物會(huì)通過(guò)阻斷復(fù)極過(guò)程中的外向K+電流，引起心臟復(fù)極化延

3、遲導(dǎo)致QT間期延長(zhǎng)，復(fù)極化過(guò)程延遲易誘發(fā)早后除極（early after depolarization，EAD）觸發(fā)異常電興奮，加上復(fù)極離散度增大易發(fā)興奮折返，大大增加心臟發(fā)生室性心動(dòng)過(guò)速的危險(xiǎn)，最嚴(yán)重的后果是引發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過(guò)速?；趯?duì)藥物此種潛在致命性威脅的認(rèn)識(shí)，國(guó)際人用藥物協(xié)會(huì)（ICH）2004年發(fā)布技術(shù)指導(dǎo)原則，要求新藥研發(fā)過(guò)程中全面研究藥物對(duì)QT間期的影響，2014年后我國(guó)亦頒布了“藥物QT間期延長(zhǎng)潛在作用非臨床研究技術(shù)

4、指導(dǎo)原則”，對(duì)新藥研發(fā)過(guò)程相關(guān)的非臨床安全評(píng)價(jià)做出了明確要求。近年通過(guò)對(duì)QT延長(zhǎng)藥物致心律失常的大量研究，特別是借助于對(duì)遺傳性LQTs研究的認(rèn)識(shí)，對(duì)該類(lèi)藥物引發(fā)心律失常的分子、細(xì)胞機(jī)制基本達(dá)成共識(shí)?，F(xiàn)行的QT延長(zhǎng)藥物非臨床評(píng)價(jià)模式是以QT的延長(zhǎng)作為風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物，然而大量的研究表明QT延長(zhǎng)本身并不一定與TdP發(fā)生完全一致，需要用一些其它敏感、特異性標(biāo)志物對(duì)藥物潛在風(fēng)險(xiǎn)高低做出評(píng)價(jià)?；谘娱L(zhǎng)QT間期藥物致心律失常發(fā)生分子、細(xì)胞機(jī)制有人提出動(dòng)作

5、電位三角形變（triangulation），反向頻率使用依賴性（reverse use dependence），QT短期不穩(wěn)定性（short-term instability）以及跨壁復(fù)極離散度（TDR）是藥物致心律失常較好的標(biāo)志物。此外，尚有一些其它標(biāo)志物如 QT/HR間期變異度、iCEB（QT/QRS）等。
　　與上述延長(zhǎng)QT間期的藥物相反，有些藥物促進(jìn)動(dòng)作電位復(fù)極，具有縮短QT間期的作用。近幾年在離子通道藥物研究中發(fā)現(xiàn)了一些

6、鉀通道激動(dòng)劑，已成功用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。與此同時(shí)，作用于心肌細(xì)胞鉀通道的激動(dòng)劑能夠縮短動(dòng)作電位時(shí)程和QT間期，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)多種小分子化合物可以特異性的作用于心肌細(xì)胞上的各種鉀通道，從而引起APD和QT間期縮短。在了解延長(zhǎng)QT間期藥物致心律失常風(fēng)險(xiǎn)后，顯而易見(jiàn)的問(wèn)題是縮短QT間期藥物是否也具有同樣的風(fēng)險(xiǎn)？近年臨床報(bào)道的遺傳性SQTs及其相關(guān)研究，使人們對(duì)此問(wèn)題有了新的認(rèn)識(shí)。2000年Gussak等人報(bào)導(dǎo)了一種以QT間期縮短并伴有惡性心率失

7、常為特征的遺傳性疾病，將其命名為short QT syndrome(SQTS)。SQTs在心電圖上主要表現(xiàn)為QT間期明顯縮短（QTc≤300 ms），常伴發(fā)心室顫動(dòng)等惡性心率失常。
　　我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)hERG通道激動(dòng)劑ICA-105574具有一定的抗復(fù)極延遲所致心律失常作用，但同時(shí)能夠縮短QT間期和APD，可能具有潛在致心律失常作用，而IKs，IK1，IKATP等特異性鉀通道激動(dòng)劑均有報(bào)道能夠縮短QT間期和APD，這些激動(dòng)劑是

8、否具有潛在的致心律失常作用尚不明確。
　　另外，現(xiàn)行的“藥物QT間期延長(zhǎng)潛在作用非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則”以及前已述及的用于評(píng)價(jià)QT間期延長(zhǎng)藥物潛在致心律失常發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物是否適用于縮短QT間期藥物，目前尚無(wú)依據(jù)和法規(guī)支持。國(guó)際制藥行業(yè)亦無(wú)相關(guān)安全性評(píng)價(jià)的技術(shù)指導(dǎo)原則。因此，對(duì)于縮短QT間期藥物來(lái)講，建立一套評(píng)價(jià)其誘發(fā)心律失常的評(píng)價(jià)系統(tǒng)以及尋找能夠預(yù)測(cè)心律失常發(fā)生的生物標(biāo)志物尤為重要。
　　本研究以不同鉀通道開(kāi)放劑為工具藥，

9、擬通過(guò)Langendorff離體灌流心臟模型、標(biāo)準(zhǔn)玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)記錄技術(shù)、動(dòng)作電位鉗技術(shù)，從不同水平結(jié)合多種電生理技術(shù)，研究心臟不同靶點(diǎn)縮短QT藥物的致心律失常風(fēng)險(xiǎn)特征、探討致心律失常的細(xì)胞機(jī)制、并尋找致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物。研究將為創(chuàng)新藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)提供新的參考，同時(shí)為解釋藥物致心律失常機(jī)制、臨床規(guī)避藥物風(fēng)險(xiǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分：豚鼠和兔離體心臟對(duì)縮短QT間期藥物敏感性比較
　　目的：
　　觀察豚鼠和

10、家兔離體心臟對(duì)不同縮短QT間期藥物的敏感性異同，并評(píng)估縮短QT間期藥物潛在致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)和類(lèi)型。
　　方法：
　　利用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，選擇不同類(lèi)型的鉀通道開(kāi)放劑：hERG通道開(kāi)放劑ICA-105574和NS-1643，IKs開(kāi)放劑R-L3，ATP敏感鉀通道開(kāi)放劑吡那地爾（Pinacidil）。觀察心電圖（ECG）各參數(shù)的變化，并比較豚鼠和家兔心律失常發(fā)生率的異同。實(shí)驗(yàn)程序如下：為觀察不同濃度鉀通道開(kāi)

11、放劑對(duì)心電圖各參數(shù)的影響，首先心臟穩(wěn)定一小時(shí)以保證記錄到穩(wěn)定可靠的心電圖；以含0.1％DMSO的臺(tái)氏液作為對(duì)照溶液灌流心臟30分鐘，再按照低、中、高的濃度順序依次灌流鉀通道開(kāi)放劑，觀察鉀通道開(kāi)放劑對(duì)兩種不同動(dòng)物種屬的致心律失常發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和類(lèi)型。
　　結(jié)果：
　　1.hERG通道開(kāi)放劑：ICA-105574可濃度依賴性縮短豚鼠QT間期，在高濃度（10μM）縮短程度可達(dá)50%以上（n=8，P<0.01），并且引起顯著的T波倒置，隨

12、之伴發(fā)non-TdP-like VT/VF樣心律失常，心律失常發(fā)生率達(dá)62.5%（n=8）。與之相比，ICA-105574同樣濃度依賴性的縮短家兔離體心臟QT間期，在10μM對(duì)QT間期的縮短程度達(dá)46%（n=6，P<0.01），可引起T波倒置并誘發(fā)心律失常，發(fā)生率為50%（n=6）。NS-1643是作用機(jī)制不同于ICA-105574的另外一種hERG通道開(kāi)放劑，同樣可以濃度依賴性的縮短豚鼠和家兔的QT間期，高濃度時(shí)其縮短程度分別可達(dá)20

13、%（n=5，P<0.01）和15%（n=5，P<0.05）。值得注意的是在豚鼠心臟模型中心律失常發(fā)生率為60%（n=5），在兔離體模型中未見(jiàn)心律失常的發(fā)生。
　　2.IKs開(kāi)放劑：R-L3相比較于上述兩種hERG通道開(kāi)放劑，對(duì)QT間期的縮短程度明顯低于二者。高濃度時(shí)在豚鼠和兔心臟模型僅縮短15%和7%（n=5），同時(shí)可誘發(fā)VT/VF，豚鼠心律失常發(fā)生率為40%（n=5），在兔離體模型中未見(jiàn)心律失常的發(fā)生。
　　3.ATP敏感

14、鉀通道開(kāi)放劑：吡那地爾（Pinacidil）濃度依賴性的縮短豚鼠（n=7）和兔離體心臟QT間期（n=6），30μM Pinacidil在7例豚鼠心臟中誘發(fā)了4例產(chǎn)生心律失常，而兔離體心臟中未見(jiàn)有心律失常發(fā)生。
　　小結(jié)：
　　四種鉀通道開(kāi)放劑可顯著縮短豚鼠離體心臟QT間期，并誘發(fā)VT/VF；對(duì)于兔離體心臟模型而言，只有ICA-105574在高濃度時(shí)可誘發(fā)VT/VF，其余三種鉀通道開(kāi)放劑并未誘發(fā)心律失常。相比較于兔心臟模型，豚

15、鼠心臟模型對(duì)鉀通道開(kāi)放劑更為敏感，可作為評(píng)估縮短QT間期藥物潛在致心律失常風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物模型。
　　第二部分：縮短QT間期藥物對(duì)豚鼠離體心電圖各參數(shù)的影響
　　目的：
　　觀察縮短QT間期藥物對(duì)豚鼠離體心電圖各參數(shù)的影響，并尋找預(yù)測(cè)心律失常發(fā)生的生物標(biāo)志物。
　　方法：
　　1.利用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，將兩個(gè)電極置于離體心臟的主動(dòng)脈根部和心尖部，通過(guò)BIOPAC/MP150多道生理測(cè)定系統(tǒng)記

16、錄給予不同濃度縮短QT間期藥物后心電圖（ECG）的變化，并采用受試者工作曲線對(duì)心電圖各參數(shù)進(jìn)行分析，尋找預(yù)測(cè)心律失常發(fā)生敏感性和特異性較高的生物標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)程序如下：為觀察不同濃度縮短QT間期藥物對(duì)心電圖各參數(shù)的影響，首先心臟穩(wěn)定一小時(shí)以保證記錄到穩(wěn)定可靠的心電圖；以含0.1%DMSO的臺(tái)氏液作為對(duì)照溶液灌流心臟30分鐘，再按照低、中、高的濃度順序依次灌流縮短QT間期藥物，觀察給予縮短QT間期藥物前后心電圖各參數(shù)的變化。
　　2.

17、受試者工作曲線（ROC curve）是臨床診斷常用的一種分析方法，可用于兩種或兩種以上不同診斷試驗(yàn)對(duì)疾病識(shí)別能力的比較。在對(duì)同一種疾病的兩種或兩種以上診斷方法進(jìn)行比較時(shí)，可將各個(gè)診斷結(jié)果的ROC曲線繪制到同一坐標(biāo)中，以直觀的鑒別其診斷價(jià)值的高低，靠近左上角的ROC曲線所代表的診斷價(jià)值最準(zhǔn)確。也可以通過(guò)分別計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的ROC曲線下的面積（AUC）進(jìn)行比較，曲線下面積（AUC）越大的參數(shù)代表其診斷的準(zhǔn)確性越高，一般來(lái)說(shuō)AUC>0.9說(shuō)明該

18、參數(shù)具有較高準(zhǔn)確性、AUC在0.7-0.9時(shí)有一定的準(zhǔn)確性、AUC在0.5-0.7時(shí)有較低的準(zhǔn)確性。
　　結(jié)果：
　　1.hERG通道開(kāi)放劑：ICA-105574濃度依賴性的顯著縮短QT間期、JTpeak間期（代表早期復(fù)極時(shí)程）、iCEB（QT/QRS的比值）。同時(shí)ICA-105574濃度依賴性的增大JT area（代表跨壁復(fù)極離散度）。ICA-105574在高濃度（10μM）時(shí)QT間期變異度和心率變異度顯著增加，8例豚鼠心

19、臟中有5例發(fā)生了心律失常。采用受試者工作曲線分析以上ECG各參數(shù)，結(jié)果顯示JTpeak間期、JT area、Tp-e等三個(gè)參數(shù)的曲線下面積大于0.9，提示上述三個(gè)參數(shù)預(yù)測(cè)ICA-105574誘發(fā)心律失常的準(zhǔn)確度更高。NS-1643在三個(gè)測(cè)試濃度中均可以濃度依賴性的縮短QT間期和JTpeak間期，在高濃度時(shí)（10μM）顯著降低iCEB。同ICA-105574一樣，NS-1643濃度依賴性的增大JT area。在給予10μM的NS-1643

20、后，5例心臟中3例出現(xiàn)VT或VF，值得注意的是僅在高濃度時(shí)PR間期顯著延長(zhǎng)，提示NS-1643對(duì)房室傳導(dǎo)可能有一定的阻滯作用。采用受試者工作曲線分析以上ECG各參數(shù)，結(jié)果顯示JTpeak間期、JT area、心率變異度等三個(gè)參數(shù)的曲線下面積大于0.9，提示上述三個(gè)參數(shù)預(yù)測(cè)NS-1643誘發(fā)心律失常的準(zhǔn)確度更高。
　　2.IKs開(kāi)放劑：R-L3濃度依賴性的縮短QT間期和JTpeak間期，與NS-1643相似，R-L3只在高濃度（10

21、μM）時(shí)降低iCEB。除此之外， JT area隨濃度增加而增大，最高可增大至對(duì)照的四倍。高濃度R-L3誘發(fā)VT/VF的發(fā)生率為40%。受試者工作曲線分析以上ECG各參數(shù)，結(jié)果顯示JTpeak間期、JT area兩個(gè)參數(shù)的曲線下面積大于0.9，提示二者預(yù)測(cè)R-L3誘發(fā)心律失常的準(zhǔn)確度更高。
　　3.ATP敏感鉀通道開(kāi)放劑：給予不同濃度的Pinacidil后QT間期、JTpeak間期、iCEB均呈濃度依賴性的縮短或降低。與此同時(shí)，T

22、p-e和JT area顯著升高。給予20μM的Pinacidil后，7例心臟中的4例發(fā)生心律失常。受試者工作曲線分析顯示，JTpeak間期、JT area兩個(gè)參數(shù)的曲線下面積大于0.9，提示二者預(yù)測(cè)Pinacidil誘發(fā)心律失常的準(zhǔn)確度更高。
　　小結(jié)：
　　四種不同類(lèi)型的鉀通道開(kāi)放劑可不同程度的影響豚鼠離體心電圖各參數(shù)，ROC曲線分析顯示，JTpeak間期的縮短和JT area的增大在能較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)鉀通道開(kāi)放劑潛在致心律失常

23、風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，結(jié)果提示，加速早期復(fù)極和跨壁復(fù)極離散度的增大可能是鉀通道開(kāi)放劑誘發(fā)心律失常的主要機(jī)制。
　　第三部分：縮短QT間期藥物對(duì)豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位和電流的影響
　　目的：
　　觀察縮短QT間期藥物對(duì)豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位各參數(shù)的影響，并探討其致心律失常的發(fā)生機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用標(biāo)準(zhǔn)玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)記錄技術(shù)，記錄豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位，觀察在不同刺激頻率下（0.2 Hz、1 Hz、2 Hz）給予不同濃

24、度鉀通道開(kāi)放劑后，動(dòng)作電位復(fù)極化30%時(shí)間（APD30，代表動(dòng)作電位早期復(fù)極參數(shù)）、動(dòng)作電位復(fù)極化90%時(shí)間（APD90）、APD90-30（反映復(fù)極中晚期時(shí)程）和有效不應(yīng)期（ERP）以及對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位頻率依賴性的影響。并觀察觸發(fā)活動(dòng)（早后除極或遲后除極）的發(fā)生情況，采用受試者工作曲線對(duì)給予縮短QT間期藥物前后動(dòng)作電位各參數(shù)進(jìn)行分析，尋找在動(dòng)作電位水平能預(yù)測(cè)觸發(fā)活動(dòng)發(fā)生的標(biāo)志物。
　　2.在急性分離的心肌細(xì)胞上，利用動(dòng)作電

25、位鉗技術(shù)，觀察四種縮短QT間期藥物對(duì)心肌細(xì)胞復(fù)極過(guò)程中外向電流的影響。首先，在豚鼠心室肌細(xì)胞上，電流鉗模式下記錄動(dòng)作電位，以此記錄到的動(dòng)作電位波形作為刺激protocol記錄復(fù)極過(guò)程中外向鉀電流的變化。記錄外向電流的溶液：電極內(nèi)液（mmol/L）：KCl140，Mg-ATP4，MgCl21，EGTA5，HEPES10，用KOH調(diào)pH至7.2。電極外液（mmol/L）：NMG130，KCl5.4，MgCl21，CaCl22，glucose

26、10，HEPES10用NaOH調(diào)pH至7.4。CdCl2（300μM）加入到外液中阻斷鈣電流。
　　3.在急性分離的心肌細(xì)胞上，利用動(dòng)作電位鉗技術(shù)，觀察四種縮短QT間期藥物對(duì)心肌細(xì)胞復(fù)極過(guò)程中內(nèi)向電流的影響。單個(gè)室性動(dòng)作電位波刺激誘發(fā)內(nèi)向電流。記錄內(nèi)向電流的溶液：電極內(nèi)液（mmol/L）：CsOH70,aspartic acid80,CsCl40,NaCl10,MgCl22,HEPES10,EGTA10,MgATP5, Na2GT

27、P0.2, Na2-phosphocreatine4,用CsOH調(diào)pH至7.2。電極外液（mmol/L）：NaCl130，CsCl5.4，MgCl21，CaCl22，glucose10，HEPES10用NaOH調(diào)pH至7.4。
　　結(jié)果：
　　1.首先，我們考察了四種鉀通道開(kāi)放劑對(duì)動(dòng)作電位反向使用頻率依賴性的影響，結(jié)果顯示：在高中低三個(gè)濃度，均不影響動(dòng)作電位的頻率依賴性。
　　2.動(dòng)作電位各參數(shù)的變化：為了更直觀的觀察

28、鉀通道開(kāi)放劑作用于心肌復(fù)極過(guò)程中哪一時(shí)期，我們對(duì)復(fù)極時(shí)程進(jìn)行分段考量即：APD30和APD90-30。在2Hz刺激頻率下，四種鉀通道開(kāi)放劑均可濃度依賴性的縮短APD90、APD30和有效不應(yīng)期（ERP），除高濃度Pinacidil外，另外三種鉀通道開(kāi)放劑對(duì)APD90-30均無(wú)顯著影響。
　　3.EAD或DAD發(fā)生率：我們考察了在三個(gè)刺激頻率0.2 Hz、1 Hz、2 Hz刺激下觸發(fā)活動(dòng)的發(fā)生情況，結(jié)果顯示：在0.2Hz和1Hz刺激

29、下未見(jiàn)EAD或DAD發(fā)生；在2Hz刺激下，除Pinacidil外，其余三種鉀通道開(kāi)放劑在高濃度時(shí)均誘發(fā) EAD或 DAD的發(fā)生。其中，給予10μM ICA-105574后，6例標(biāo)本中4例出現(xiàn)EAD現(xiàn)象，而且EAD發(fā)生在復(fù)極早期階段；10μM NS-1643可誘發(fā)5例標(biāo)本中4例出現(xiàn)DAD；IKs開(kāi)放劑 R-L3誘發(fā) DAD的發(fā)生率高達(dá)100%，5例標(biāo)本在2Hz刺激條件下全部發(fā)生DAD。
　　4.受試者工作曲線分析動(dòng)作電位各參數(shù)：對(duì)以

30、上各動(dòng)作電位參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：APD90和APD30兩個(gè)參數(shù)的曲線下面積大于0.9，提示，二者預(yù)測(cè)ICA-105574、NS-1643和R-L3誘發(fā)EAD/DAD的準(zhǔn)確度更高。值得注意的是，三種鉀通道開(kāi)放劑的APD90和APD30兩個(gè)參數(shù)曲線下面積完全相同即二者預(yù)測(cè)能力完全相同，提示我們，APD90的縮短可能來(lái)自于APD30的貢獻(xiàn)更多。
　　5.四種鉀通道開(kāi)放劑對(duì)復(fù)極過(guò)程中外向鉀電流的影響：四種鉀通道開(kāi)放劑均可濃度依賴性的增

31、加早期復(fù)極過(guò)程外向電流的幅度，然而增加的方式卻不盡相同，ICA-105574對(duì)電流的增加主要集中在APD30時(shí)程下，呈現(xiàn)“穹頂”式增加；NS-1643則是“爬坡”式增加外向電流；IKs開(kāi)放劑R-L3對(duì)外向電流的增大方式與ICA-15574相似，但是增幅要小于ICA-105574；Pinacidil均勻增加整個(gè)復(fù)極過(guò)程中外向電流的幅值，這也可能是其未誘發(fā) EAD或 DAD的原因所在。接下來(lái)我們又在急性分離的豚鼠心室肌細(xì)胞上驗(yàn)證了鉀通道開(kāi)放