免疫增效型廣譜抗腫瘤血管生成基因疫苗的基礎(chǔ)研究.pdf

1、背景與目的：
　　 上世紀(jì)70年代由Judah Folkman提出的有關(guān)腫瘤血管生成的理論已被廣泛接受，目前，抗腫瘤血管生成已經(jīng)成為腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究及臨床治療領(lǐng)域中最有前景的策略之一。大量研究證據(jù)表明，在眾多的血管生成刺激因子中，內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體VEGFR2（鼠中稱為flk-1，人中稱為KDR）對于與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的血管生成是最重要的，許多旨在通過打破VEGF/VEGFR2傳導(dǎo)通路抑制腫瘤血管生成的主動(dòng)免疫

2、實(shí)驗(yàn)研究都取得了比較理想的結(jié)果，還有研究表明，與全長基因疫苗相比，編碼VEGFR2胞外1-4區(qū)的基因疫苗同樣能夠有效降低小鼠血清中VEGF水平，從而抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。
　　 構(gòu)建一種能夠誘導(dǎo)有效免疫反應(yīng)基因疫苗的關(guān)鍵是打破對靶抗原的自身免疫耐受，在這項(xiàng)研究中我們主要采取三項(xiàng)措施解決這一問題。首先，選取異種同源的小鼠VEGFR2胞外1-4 IgG樣區(qū)域（簡稱mVEGFR2（1-4））作為疫苗的靶抗原；其次，將人白細(xì)胞介素12（

3、hIL-12）融合基因插入到載體IRES序列的下游，構(gòu)建一個(gè)下游可以同時(shí)表達(dá)hIL-12雙亞基的雙順反子真核表達(dá)載體pVAX1-IRES-hIL12，hIL-12作為對體內(nèi)細(xì)胞和體液免疫系統(tǒng)作用最強(qiáng)的免疫活性因子及一種抗血管生成因子，在基因疫苗中以免疫佐劑的形式發(fā)揮作用；最后，為了增強(qiáng)本疫苗的免疫粘附及抗原遞呈功能，本研究利用真核表達(dá)載體pCI-Fc-GPI，實(shí)現(xiàn)了人Igκ前導(dǎo)信號肽、人IgG-Fc段及GPI與靶抗原mVEGFR2（1-

4、4）的共同表達(dá)，成功構(gòu)建了免疫增效型廣譜抗腫瘤血管生成基因疫苗pVAX1-sig-mVEGFR2（1-4）-Fc-GPI-IRES-hIL12（簡稱pVAX1-mVEGFR2-hIL12）。
　　 方法：
　　 通過搭橋PCR獲得人白細(xì)胞介素12 P35及P40雙亞基的融合基因P35-F2A-P40，插入已構(gòu)建好的DNA疫苗載體pVAX1-IREST游，構(gòu)建質(zhì)粒載體pVAX1-IRES-hiL12；通過RT-PCR的方法

5、從Balb/c小鼠胚胎組織中特異性擴(kuò)增mVEGFR2（1-4）基因，連接到真核表達(dá)載體kpVAX1-IRES-hIL12的上游，構(gòu)建基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hIL12。脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用ELISA、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測293T細(xì)胞中hIL-12和mVEGFR2（1-4）基因的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 特異性擴(kuò)增得到大小與mVEGFRa（1-4）基因相符的基因片段，序列測定證實(shí)與Ge

6、nBank（GI：57923）上登錄的序列一致；酶切鑒定和序列分析表明P35及P40雙亞基融合基因P35-F2A-P40與設(shè)計(jì)完全一致，融合基因在體外細(xì)胞培養(yǎng)液檢測中獲得分泌表達(dá)；成功構(gòu)建了廣譜抗腫瘤血管生成基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hIL12。FACS及IMF檢測證實(shí)重組基因疫苗得到有效表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了免疫增效型廣譜抗腫瘤血管基因疫苗pVAX1-mVEGFR2-hiL12，為后續(xù)研究中進(jìn)