鉀通道介導Aβ的神經(jīng)毒及HN的拮抗作用：電生理和凋亡的實驗觀察.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)，又稱老年癡呆，是以記憶、認知功能受損為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，其典型的病理學特征為老年斑(senileplaque，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangle，NFT)和大量的神經(jīng)元喪失。β—淀粉樣蛋白(β—amyloidprotein，Aβ)是老年斑的主要成分，由39～43個氨基酸組成。有關(guān)Aβ1-40和Aβ1-42完整肽鏈的神經(jīng)毒作用已有廣泛的報道。

2、研究發(fā)現(xiàn)Aβ25-35，一個短的分子片斷，具有與Aβ完整肽鏈相同的神經(jīng)毒作用，因此被廣泛應用于AD的實驗研究。由于Aβ被普遍認為是AD的關(guān)鍵性致病因素，在AD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，因而深入研究其毒性作用機制，從而抑制其毒性將是防治AD的重要環(huán)節(jié)。 有關(guān)Aβ的毒性機制眾說紛紜，近來研究表明，Aβ通過擾亂細胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，影響膜電生理特性而發(fā)揮重要作用。大量研究證實，鉀離子通道的功能紊亂在AD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。鉀離子通道能夠

3、影響胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)、細胞容積，并通過調(diào)節(jié)膜電位調(diào)控遞質(zhì)釋放、激素分泌等生理功能。在幾乎所有興奮性細胞和絕大多數(shù)非興奮性細胞靜息膜電位的維持過程中鉀通道發(fā)揮主要作用，同時還可影響動作電位的頻率和時程，由此調(diào)控細胞的興奮性以及參與Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。此外，研究表明，鉀通道在學習記憶中發(fā)揮重要作用，鉀通道與Cp20(一種分子量為20kDa的GTP結(jié)合蛋白)、胞內(nèi)鈣離子、蛋白激酶C(PKC)共同參與學習和記憶的過程。病理條件下，如發(fā)生AD時中樞神

4、經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中均存在鉀通道功能異常。近來研究還發(fā)現(xiàn)，鉀通道除影響膜電生理特性、興奮性和鈣穩(wěn)態(tài)及一些生理及病理過程，還參與神經(jīng)元凋亡的誘導，促進凋亡發(fā)生。 蛋白激酶C(PKC)作為細胞內(nèi)重要的信號物質(zhì)，參與許多生理功能的調(diào)節(jié)。在對鉀通道的調(diào)節(jié)過程中，PKC尤為重要。研究顯示，PKC激活可使鉀電流抑制。而且有證據(jù)顯示，Aβ的毒性作用與PKC密切相關(guān)。本研究室以往的研究也證實PKC介導了Aβ31-35引起的海馬長持續(xù)—長時程(L—

5、LTP)壓抑。那么，PKC是否也參與了Aβ所致的鉀通道功能的異常改變呢?此外，本室及其他的研究者以往的工作表明，Aβ能引起神經(jīng)元細胞活力降低、促進凋亡發(fā)生，那么鉀通道是否也參與Aβ引起的細胞凋亡過程? 基于上述的研究背景，為進一步明確Aβ對鉀通道功能的影響及鉀通道功能異常產(chǎn)生的毒性作用；為明確HN拮抗Aβ神經(jīng)毒的電生理(鉀通道)機制；明確PKC在Aβ引起鉀通道功能異常時的作用及HN的拮抗作用；明確鉀通道在Aβ所致凋亡中的作用以及

6、HN的神經(jīng)保護作用，本研究設(shè)計了以下三部分實驗： 第一部分：Aβ25-35介導的鈣非依賴性鉀電流的抑制及HN的拮抗作用。 為了深入理解Aβ的神經(jīng)毒作用的離子機制及探討HN發(fā)揮神經(jīng)保護作用的電生理機制，本實驗利用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察Aβ25-35對急性分離的海馬神經(jīng)元鈣非依賴性的鉀電流(包括快速失活鉀電流(fasttransientcurrent，IA)和延遲整流鉀電流(delayedrectifier—likecurre

7、nt，IK))的影響以及HN的拮抗作用。實驗過程中，采用三種不同的給藥順序進行觀察，即在灌流Aβ之前、同時或之后給予同等濃度的HN。在全細胞電壓鉗記錄的條件下，給予細胞由-40～+70mV(階躍10mV)的去極化脈沖，分別記錄鈣非依賴性的總的鉀電流和IK電流，再經(jīng)公式換算得出IA。依據(jù)文獻報道，IK取其158ms處的穩(wěn)態(tài)電流，而IA取其峰值電流進行分析。在同一海馬神經(jīng)元上，比較HN不同的給藥方式對Aβ引起的鉀電流作用的影響。 結(jié)果

8、表明： (1)急性給予Aβ25-35可使分離神經(jīng)元的鈣非依賴性的總的鉀電流包括IK、IA抑制，這種作用可能通過提高興奮性影響鈣穩(wěn)態(tài)，如形成鈣超載而發(fā)揮毒性作用； (2)HN拮抗Aβ25-35介導的對鈣非依賴性鉀電流的抑制以及胞內(nèi)鈣升高； (3)電壓依賴性鉀通道可能是HN拮抗Aβ發(fā)揮神經(jīng)保護作用的靶點之一； (4)結(jié)合以往實驗和本實驗結(jié)果推測，HN和Aβ可能作用于細胞膜同一靶點而發(fā)揮作用，HN比Aβ可能更具有親和力

9、。 第二部分：PKC介導的Aβ25-35對鉀通道的抑制及HN的拮抗作用。 鑒于PKC在鉀通道調(diào)節(jié)過程中的重要作用，即PKC激活可抑制鉀電流以及廣泛報道的PKC介導Aβ的毒性作用。在第一部分研究結(jié)果的基礎(chǔ)上(Aβ抑制鈣非依賴性鉀電流)，通過使用PKC的激動劑PDBu和阻斷劑chelerythrine，應用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察PKC是否介導了Aβ對鈣非依賴性鉀電流的抑制和HN的拮抗作用。同時，采用蛋白免疫印跡技術(shù)進一步觀察A

10、β對PKC的活化以及HN的拮抗作用。 結(jié)果表明： (1)PKC激動劑劑量依賴性的抑制IK，即激活PKC模擬了Aβ對鉀通道的作用； (2)Aβ能夠活化(磷酸化)神經(jīng)元PKC，活化的PKC介導了對鉀通道的抑制，而PKC阻斷劑拮抗Aβ引起的IK電流的抑制； (3)HN抑制Aβ誘導的PKC的活化(磷酸化)； (4)HN拮抗PKC介導的Aβ對IK的抑制。 綜上，Aβ通過活化PKC介導其對鉀通道的作用

11、，這可能是Aβ毒性作用的重要機制之一，抑制Aβ對PKC的活化及抑制PKC介導的毒性作用可能是HN拮抗Aβ神經(jīng)毒的機制之一。 第三部分：鉀通道開放介導的Aβ25-35致凋亡及HN的拮抗作用。 前一部分的實驗及其他一些電生理實驗觀察顯示，Aβ能夠抑制鉀通道開放及鉀電流，使膜電位負值變小，由此導致膜容易去極化，動作電位的時程和有效不應期延長，胞內(nèi)鈣內(nèi)流增多，繼發(fā)鈣超載，從而導致細胞毒性。新近的文獻報道，鉀通道開放增加、鉀外流增

12、多亦可產(chǎn)生毒性作用，但不是影響興奮性和鈣信號而是誘導凋亡。在培養(yǎng)的神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)慢性孵育Aβ通過引起鉀通道開放增加，大量鉀外流誘導凋亡發(fā)生。上述Aβ對鉀通道的不同作用(通道抑制，鉀電流減少或通道開放，鉀外流增加)是在不同的實驗條件下觀察的結(jié)果，前者是在電生理記錄條件下通過急性給藥觀察的結(jié)果，后者是在細胞培養(yǎng)條件下慢性孵育藥物觀察的結(jié)果。在完成了電生理條件下進行的Aβ對鉀通道功能影響的觀察后，設(shè)計了本部分實驗，即使用原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，觀察

13、鉀通道在Aβ引起的神經(jīng)元凋亡中的作用及HN的拮抗作用。 實驗中采用鉀通道的阻斷劑，包括對IK敏感的TEA和其同源類似物TPeA以及對IA敏感的4—AP以及使用高濃度的KCl提高細胞外鉀離子濃度來抑制鉀離子外流，觀察阻止鉀離子過渡外流能否拮抗Aβ引起的神經(jīng)元死亡；同時應用鉀離子的載體valinomycin(相當于開放劑)誘導神經(jīng)元凋亡(這是目前研究鉀外流增多引起凋亡的通用模型)，在此基礎(chǔ)上觀察HN對鉀外流增多引起凋亡的拮抗作用，明

14、確HN拮抗Aβ引起神經(jīng)元死亡的可能機制。實驗過程采用原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，通過細胞毒性檢測方法(cck-8試劑盒，乳酸脫氫酶試劑盒，Calcein—AM染色)和凋亡檢測方法(流式細胞術(shù)，caspase-3試劑盒，TUNEL染色)分析鉀通道在Aβ誘導的細胞凋亡中的作用。 結(jié)果表明： (1)在離體神經(jīng)細胞培養(yǎng)的條件下，Aβ導致培養(yǎng)神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡； (2)Aβ引起的神經(jīng)元凋亡與慢性孵育Aβ引起鉀通道開放導致鉀離子大量外

15、流有關(guān)； (3)HN可拮抗鉀通道開放誘導的神經(jīng)元凋亡。綜上，HN可通過拮抗鉀通道開放抑制Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡，這可能是HN拮抗Aβ致凋亡作用的機制之一。 綜上結(jié)果，可得出如下結(jié)論： (1)急性給予Aβ25-35可使分離的神經(jīng)元鈣非依賴的鉀通道(鉀電流)抑制，包括IA和IK，進而引起細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高；HN可拮抗由Aβ25-35誘導的鈣非依賴性的鉀電流的抑制以及胞內(nèi)鈣升高； (2)Aβ25-35可能通過

16、活化PKC系統(tǒng)介導對鉀電流的抑制； (3)HN通過拮抗Aβ25-35誘導的PKC活化(磷酸化)從而拮抗Aβ25-35誘導的對鉀電流的抑制； (4)慢性孵育Aβ25-35導致培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡，鉀通道的大量開放可能是介導Aβ25-35致凋亡的機制之一； (5)HN可通過拮抗鉀通道開放抑制Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡，這可能是HN拮抗Aβ致凋亡作用的機制之一； (6)鉀通道功能異常無論是開放抑制(鉀電流減小)或開放增加

17、(鉀外流增加)均可造成毒性作用，前者通過提高神經(jīng)興奮性或引起胞內(nèi)鈣超載而產(chǎn)生毒性作用，而后者則通過誘導凋亡發(fā)揮毒性作用； (7)不同的實驗條件及給藥方式可能通過不同的機制使Aβ產(chǎn)生對鉀通道的不同效應。電生理記錄過程的急性給藥使通道抑制，鉀電流減??；而細胞培養(yǎng)過程的慢性孵育可使通道開放增加，鉀外流增加。急性給藥產(chǎn)生的鉀通道抑制可能是Aβ對膜通道及膜電流產(chǎn)生的直接效應，而慢性孵育可能是由于上調(diào)了鉀通道蛋白表達，使其數(shù)量增加，開放增加