Aβl-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中鉀通道和JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化.pdf

1、目的：
　　探討鉀通道在Aβl-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮的作用；探討JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在Aβl-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中的作用；以及鉀通道與JNK的關(guān)系。進(jìn)一步了解阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的發(fā)病機(jī)制，從而為開發(fā)治療AD藥物提供新的思路和方法。
　　方法：
　　1.分離提取新生的Wistar大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，應(yīng)用Nestin細(xì)胞免疫化學(xué)法鑒定。
　　2

2、.應(yīng)用MTT法檢測TEA干預(yù)Aβ1-40誘導(dǎo)后的神經(jīng)干細(xì)胞存活率的變化。
　　3.應(yīng)用Hoechst33342染色法在熒光顯微鏡紫外激發(fā)下觀察神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。
　　4.應(yīng)用比色法檢測TEA對Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3活性的變化。
　　5.應(yīng)用Western blot法檢測Aβ1-40誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞不同時間點(diǎn)JNK磷酸化的表達(dá)。
　　6.應(yīng)用MTT法檢測 SP600125干預(yù) Aβl

3、-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞存活率的變化。
　　7.應(yīng)用Hoechst33342染色法在熒光顯微鏡紫外激發(fā)下觀察神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。
　　8.應(yīng)用比色法檢測SP600125干預(yù)后Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3活性的變化。
　　9.由于Aβl-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞 JNK磷酸化激活在24h達(dá)到高峰，故在這個時間點(diǎn)，孵育前30min加入TEA5mM，應(yīng)用 Western blot方法檢測TEA對Aβl-4

4、0誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞JNK磷酸化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.12h內(nèi)新生大鼠海馬區(qū)分離的單個神經(jīng)干細(xì)胞相互聚集成團(tuán)狀，3d后呈透亮的圓形，傳代培養(yǎng)至第三代可見培養(yǎng)液中形成較大的神經(jīng)球，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記性蛋白Nestin的表達(dá)陽性。
　　2.1TEA對Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組相比Aβ1-40組神經(jīng)干細(xì)胞存活數(shù)明顯減少(p＜0.05)，且隨時間延長神經(jīng)干細(xì)胞存活率下降。與Aβ1-40組

5、相比Aβ1-40+TEA組神經(jīng)干細(xì)胞存活率明顯升高(p＜0.05)。
　　2.2TEA對Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：熒光顯微鏡下Aβl-40組神經(jīng)干細(xì)胞48h后出現(xiàn)部分細(xì)胞核呈濃染的碎塊狀，為典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。與Aβl-40組相比Aβ1-40＋TEA組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化少，凋亡率11.6％±0.4%，差異具有顯著性(p＜0.01)。
　　2.3TEA對Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞Caspase

6、-3活性的影響。結(jié)果顯示：與Aβl-40組相比Aβ1-40＋TEA組在各時間點(diǎn)均可降低Caspase-3的表達(dá)(p＜0.05)，特別在24h這個時間點(diǎn)更為明顯(p＜0.01)，TEA可明顯阻止Aβl-40誘導(dǎo)凋亡蛋白Caspase-3的發(fā)生。
　　3.1Aβ1-40誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞JNK磷酸化的表達(dá)。結(jié)果顯示：在不同時間點(diǎn)，神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)Aβ1-405μM孵育后，JNK的磷酸化均有表達(dá)。與空白對照組相比Aβl-40組JNK磷酸化水平隨

7、著時間的延長表達(dá)逐漸增加，在24h達(dá)到高峰，(p＜0.01)。
　　3.2 SP600125對Aβl-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果顯示：與Aβl-40組相比Aβl-40＋SP600125組可明顯減輕神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，且隨時間的延長神經(jīng)干細(xì)胞存活率逐漸升高。
　　3.3 SP600125對Aβl-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：與Aβl-40組相比Aβl-40＋SP600125組可明顯降低神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的發(fā)生

8、，Aβl-40＋SP600125組使凋亡發(fā)生率從20.3%±0.6%降至9.6%±1.3%(p＜0.01)，而 SP600125組無明顯變化。
　　3.4 SP600125對Aβl-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3活性的影響。結(jié)果顯示：與Aβl-40組相比Aβl-40＋SP600125組隨著時間的延長可顯著減少Caspase-3的激活；Aβl-40組與Aβl-40＋SP600125組相比，差異具有顯著性（p＜0.01）。

9、r>　　4.TEA對 Aβl-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞JNK磷酸化表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：與Aβl-40組相比Aβl-40＋TEA組JNK磷酸化表達(dá)隨時間的延長顯著降低（p＜0.01）。而空白對照組和TEA組神經(jīng)干細(xì)胞JNK磷酸化表達(dá)無明顯改變，(p＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.鉀通道阻滯劑TEA可以明顯減輕Aβl-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，使神經(jīng)干細(xì)胞的存活率升高，凋亡率下降。
　　2.Aβl-40可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)