MAPKs介導(dǎo)NMDA興奮性神經(jīng)毒及Humanin的神經(jīng)保護(hù)作用觀察.pdf

1、谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo)各種興奮性突觸傳遞。在胚胎期神經(jīng)發(fā)育、成年腦的各種興奮性突觸傳遞、突觸的可塑性等方面發(fā)揮重要作用。然而，谷氨酸在突觸間隙的過度聚集可引起神經(jīng)元損傷甚至死亡，被稱為興奮性神經(jīng)毒。興奮性神經(jīng)毒參與多種神經(jīng)病理過程，如腦缺血損傷和各種神經(jīng)退行性疾病等。研究顯示，缺血或創(chuàng)傷時(shí)，腦組織間隙谷氨酸濃度迅速增高。過度聚集的谷氨酸導(dǎo)致突觸后膜谷氨酸受體的過度激活，尤以N—甲基-d—門冬氨酸(N—methyl-d—

2、aspartate，NMDA)受體為著。NMDA受體是離子型受體，受谷氨酸(內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì))或NMDA(外源性激動(dòng)劑)激活使耦聯(lián)的Ca2+通道開放，引起胞內(nèi)Ca2+升高即Ca2+信號的改變，由此發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，包括生理效應(yīng)和毒性作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)，NMDA受體激活引起的Ca2+濃度升高還可通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen—activated protein kinases，MAPKs)介導(dǎo)其毒性作用，由此導(dǎo)致細(xì)胞損傷包括凋

3、亡等。 興奮性神經(jīng)毒模型是最常用(被普遍公認(rèn))、最具毒性(既可引起壞死，也可引起凋亡)、損傷機(jī)制最復(fù)雜(涉及Ca2+超載、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、細(xì)胞壞死及凋亡等)、最具臨床意義(興奮性神經(jīng)毒參與了幾乎所有神經(jīng)病理過程，如腦缺血損傷，各種神經(jīng)退行性疾病等)的一個(gè)神經(jīng)損傷模型。MAPKs是一條多途徑信號通路，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c—JunN—末端激酶(JNK)和p38MAPK的不同途徑，且每條途徑的生理及病理意義不

4、盡相同。不同的損傷引起MAPKs的不同途徑參與，而且每條途徑活化后產(chǎn)生的生物效應(yīng)也不同。雖有報(bào)道顯示，MAPKs在NMDA的興奮性神經(jīng)毒過程發(fā)揮作用，但每條途徑的作用大小及相互間的作用并不明確。因此，在同一實(shí)驗(yàn)條件下系統(tǒng)觀察并分析NMDA—MAPKs各途徑在興奮性神經(jīng)毒過程的作用，對深化理解興奮性神經(jīng)毒機(jī)制有重要意義，而MAPKs系統(tǒng)也可能成為針對興奮性神經(jīng)毒的重要靶點(diǎn)。 Humanin(HN)是一個(gè)由24個(gè)氨基酸殘基組成的多肽

5、，首先從阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)的患者腦內(nèi)分離得到。這種多肽能有效、特異地抑制家族性AD(familial Alzheimer’sdisease，F(xiàn)AD)等多種基因突變和Aβ(amyloid beta-Peptide)誘發(fā)的神經(jīng)元死亡，因而被認(rèn)為是AD特異或AD相關(guān)毒性的神經(jīng)保護(hù)肽。所以早期的研究更多關(guān)注的是HN對AD相關(guān)毒性的神經(jīng)保護(hù)作用。近來有研究表明，HN可能具有更廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用。例如，HN可

6、使人腦血管平滑肌細(xì)胞免受Aβ誘導(dǎo)產(chǎn)生的毒性影響；也可防止未分化的PCl2細(xì)胞產(chǎn)生的由血清缺乏誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；HN還可拮抗阮病毒蛋白片段所致的皮層神經(jīng)細(xì)胞死亡和凋亡。小鼠的在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HN可以改善東莨菪堿或Aβ造成的學(xué)習(xí)記憶功能下降。本研究也發(fā)現(xiàn)，HN能保護(hù)大鼠皮層神經(jīng)元免于NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒。 鑒于以上分析，本研究的主要目的在于： (1)使用MAPKs各途徑的選擇性抑制劑系統(tǒng)觀察MAPKs通路中ERK、JNK和

7、p38MAPK三條不同途徑在介導(dǎo)NMDA毒性(細(xì)胞活力降低、細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡)過程中的作用以及HN的神經(jīng)保護(hù)作用； (2)觀察凋亡在NMDA介導(dǎo)的神經(jīng)損傷中的作用，并進(jìn)一步明確MAPK三條途徑在NMDA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用及HN的神經(jīng)保護(hù)作用； (3)在上述觀察的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確HN保護(hù)作用的機(jī)制或作用靶點(diǎn)。首先采用細(xì)胞內(nèi)鈣成像技術(shù)觀察HN對NMDA引起的鈣穩(wěn)態(tài)變化的影響；并利用WesternBlot分析NMDA對

8、MAPK三條途徑的活化及HN的拮抗作用，以明確每條途徑發(fā)揮作用的大小及HN的作用靶點(diǎn)。本研究將進(jìn)一步深化對興奮性神經(jīng)毒機(jī)制的認(rèn)識和對HN神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的理解。 第一部分、MAPKs介導(dǎo)NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷及HN拮抗作用的觀察。 NMDA受體過度激活是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷乃至死亡的主要原因，同時(shí)也被認(rèn)為是引起急、慢性腦損傷性疾病(如腦卒中/腦缺血及某些神經(jīng)退行性疾病)的重要機(jī)制。為進(jìn)一步深入分析NMDA(100μmol/L，2

9、h)所致神經(jīng)損傷的機(jī)制，本研究將應(yīng)用MAPKs特異性抑制劑，分析MAPKs通路中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c—JunN—末端激酶(JNK)和p38MAPK三條不同途徑在介導(dǎo)NMDA毒性過程中的作用。 結(jié)果提示： (1)JNK和p38MAPK途徑，而非ERK途徑，是NMDA引起神經(jīng)損傷的重要信號通路； (2)在NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷中，p38MAPK的作用比JNK更為顯著，而且這兩條途徑可能以相互協(xié)同的方式發(fā)揮

10、作用； (3)NMDA通過活化的JNK和p38MAPK途徑，使ROS的生成明顯增加，這可能是誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要機(jī)制； (4)HN可拮抗MAPKs介導(dǎo)的神經(jīng)損傷發(fā)揮保護(hù)作用，而且拮抗作用強(qiáng)于單一或聯(lián)合應(yīng)用的MAPKs抑制劑。 第二部分、MAPKs介導(dǎo)NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡及HN拮抗作用的觀察。 NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒造成神經(jīng)損傷，并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡，早期認(rèn)為主要以壞死為主。新近的資料包括本研

11、究室的研究表明，NMDA也可通過引起凋亡參與興奮性神經(jīng)毒引起的神經(jīng)元死亡。本實(shí)驗(yàn)在NMDA(100μmol/L，2h)誘導(dǎo)的興奮毒細(xì)胞模型中，應(yīng)用caspase抑制劑(阻斷caspase依賴的神經(jīng)元凋亡)檢測凋亡在NMDA所致細(xì)胞死亡中的作用(凋亡所占比例)。為進(jìn)一步明確MAPKs各信號途徑在NMDA致細(xì)胞凋亡中的作用，使用選擇性抑制劑觀察MAPK三條途徑在NMDA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。 結(jié)果表明： (1)NMDA介導(dǎo)

12、的細(xì)胞死亡除壞死外，還伴有一小部分凋亡(caspase依賴的凋亡)； (2)p38MAPK途徑，而非JNK和ERK途徑，介導(dǎo)了NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡，抑制與此相關(guān)的凋亡信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用； (3)JNK途徑可能介導(dǎo)了NMDA所致的神經(jīng)細(xì)胞壞死而非凋亡； (4)HN通過抑制NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。 第三部分、NMDA對MAPKs的活化及HN拮抗作用的觀察。 NMDA介導(dǎo)的

13、興奮性神經(jīng)毒已被廣泛研究，但有關(guān)HN對NMDA神經(jīng)毒的保護(hù)作用研究甚少。前兩部分實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，HN可有效拮抗NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，同時(shí)拮抗NMDA誘導(dǎo)的凋亡。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察NMDA對MAPKs各信號途徑的活化和HN的拮抗作用及可能的靶點(diǎn)。在本部分實(shí)驗(yàn)，首先通過觀察HN對NMDA引起的鈣信號變化的影響，明確HN是否通過與NMDA受體的直接作用而發(fā)揮作用；再利用WesternBlot技術(shù)觀察NMDA對MAPKs

14、三條途徑的活化及HN的拮抗作用。 結(jié)果提示： (1)NMDA可通過活化JNK1/2和p38MAPK途徑而發(fā)揮作用，而NMDA對ERK途徑?jīng)]有活化作用。此結(jié)果與前述阻斷劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致； (2)由于NMDA誘導(dǎo)的p38MAPK和JNK的活化(6h)早于ROS的產(chǎn)生(12h)，因此活化的p38MAPK和JNK可能通過促進(jìn)ROS的產(chǎn)生而引起細(xì)胞損傷； (3)HN拮抗NMDA—MAPKs系統(tǒng)的作用靶點(diǎn)可能不在N

15、MDA受體而是在其下游，最終影響到MAPKs的各途徑； (4)鑒于HN相對單一或聯(lián)合使用的MAPKs抑制劑表現(xiàn)出更為有效的拮抗作用，本研究推測HN除作用于JNK和p38MAPK信號途徑外，還可能通過其他信號途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。 結(jié)論： (1)本研究在同一實(shí)驗(yàn)條件(NMDA神經(jīng)毒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?下，利用不同的檢測手段系統(tǒng)觀察并分析了NMDA對MAPKs各途徑的活化及不同途徑在介導(dǎo)NMDA毒性過程的作用，深化了對NMDA

16、毒性機(jī)制的理解； (2)JNK和p38MAPK途徑，而非ERK途徑，是NMDA引起神經(jīng)損傷的重要信號通路；p38MAPK的作用比JNK更為顯著，而且這兩條途徑可能以相互協(xié)同的方式發(fā)揮作用； (3)NMDA可能通過活化JNK和p38MAPK途徑，使ROS的生成明顯增加，這可能是造成神經(jīng)損傷及誘發(fā)皮層神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要因素； (4)p38MAPK途徑，而非JNK(和ERK)途徑，介導(dǎo)了NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡；J

17、NK途徑可能介導(dǎo)了NMDA所致的神經(jīng)細(xì)胞壞死； (5)HN通過拮抗NMDA—JNK和NMDA-P38MAPK通路的活化而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用；HN作用的靶點(diǎn)可能不是NMDA受體本身而是其下游信號，最終影響到MAPKs各途徑的作用； (6)HN可能通過拮抗NMDA—JNK和NMDA-P38MAPK通路的活化而抑制ROS的產(chǎn)生，使細(xì)胞免于死亡而發(fā)揮保護(hù)作用； (7)HN除作用于JNK和p38MAPK信號途徑外，還可能通